Transformación y regeneración de plantas Allium.

Un método de transformación de células de una especie de planta Allium con un polinucleótido de interés,

que comprende los pasos de:

(i) aislar una sección de hoja inmadura de la planta Allium a transformar;

(ii) co-cultivar la sección de hoja con Agrobacterium que contiene uno o más vectores adecuados que comprenden el polinucleótido de interés durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la transferencia de la secuencia de polinucleótidos de interés a una o más células de hoja de la planta; y

(iii) transferir la sección de hoja a un medio de selección que permite la selección de las células de la planta 10 Allium transformada.

Transformación y regeneración de plantas Allium

Campo de la invención

La invención se refiere a un método de transformación de plantas de la familia Allium y a las plantas transformadas.

Antecedentes de la invención

Existen pocos protocolos publicados para la transformación y regeneración de especies de Allium. Las especies de cosecha de Allium son probablemente las especias vegetales más importantes económicamente para las cuales la tecnología de transformación es todavía difícil. Para otras cosechas de hortalizas importantes, se han producido sistemas de transformación eficientes.

Inicialmente, se creía que muchas monocotiledóneas no eran susceptibles de transformación mediada por Agrobacterium. El desarrollo de técnicas de transferencia directa de genes condujo pronto a que el bombardeo fuese el método preferido de transformación de monocotiledóneas. Sin embargo, la transferencia directa de genes no carece de problemas. A menudo, se han observado frecuencias de transformación bajas y una frecuencia elevada de patrones de integración anormales en plantas transgénicas. Recientemente, la transformación de monocotiledóneas mediada

por Agrobacterium ha ganado favor y muchas especies de monocotiledóneas (con inclusión de arroz, trigo, cebada, maíz y caña de azúcar) han sido transformadas ya utilizando este método. Un componente fundamental en el éxito de estos sistemas ha sido el uso de tipos de tejido predominantemente embriogénicos, y protocolos de selección precisos posteriores a la transformación.

Recientemente, Haseloff (1997) ha modificado el gen gfp para mejorar su uso como gen marcador transgénico en

sistemas de plantas viables. La proteína verde fluorescente (GFP) hace posible que los investigadores sigan con precisión el destino de cualesquiera células que expresen este gen y optimicen así la supervivencia de las células posterior a la transformación. Un sistema de este tipo ha sido útil en el desarrollo del protocolo de transformación de Allium consignado en esta memoria.

Como monocotiledóneas, las especies de Allium estaban predispuestas a ser reacias a la transformación. Las cebo

llas (Allium cepa L) son una cosecha con exigencias ambientales diversas. Por esta razón, han sido relativamente poco estudiadas con respecto a la aplicación de biotecnología. Existe sólo un pequeño número de informes de suministro de DNA a plantas Allium (Klein 1987; Dommisse et al. 1990; Eady et al. 1996; Barandiaran et al. 1998) . Tres investigadores utilizaron transferencia directa de genes, mientras que Dommisse et al (1990) demostraron que puede ser posible la transformación mediada por Agrobacterium. Algunos informes de protocolos de regeneración para

Alliums que son apropiados para estudios de transformación han sido publicados (Hong y Deberg 1995; Xue et al. 1997; Eady et al. 1998; Saker 1998) . Existe sólo un informe acerca del desarrollo de agentes selectivos potenciales para el uso en transformación de Allium (Eady y Lister 1998a) .

Más recientemente, US 7.112.720 describe un método de transformación de plantas de cebolla utilizando transformación mediada por Agrobacterium y empleando embriones inmaduros como la fuente de explante. Desde enton35 ces, se han publicado varios informes adicionales de transformación de cebolla (Zheng et al. 2001b; Bastar et al. 2003; Aswath et al. 2006) , puerro (Eady et al. 2005) y ajo (Kondo et al. 2000; Eady et al. 2005) . Sin embargo, todos estos informes son ineficientes y están basados en el uso de embriones inmaduros (v.g. todas las transformaciones previas de Eady et al) o el uso de tejido floral (Bastar et al. 2003) o callo derivado de tejido radicular de plantas jóvenes (Aswath et al. 2006) o callo de embriones cigóticos maduros (Zheng et al. 2001) , o callo derivado de primordios

de brotes meristemáticos (Kondo et al. 2000) . Ninguno de los protocolos desarrollados hasta ahora ha utilizado regeneración directa de tejido de hojas inmaduras como se reseña en esta invención.

Hasta la fecha, no ha sido utilizado o considerado viable tejido de hoja como fuente viable de tejido para transformación de Allium. El tejido de hoja no ha sido investigado o considerado como un material de partida útil debido a dificultades en la obtención de una transformación satisfactoria del tejido de hoja. Adicionalmente, las células de las 45 hojas de monocotiledóneas son notoriamente reacias a la regeneración, al contrario que el tejido de hoja de dicotiledóneas que se regenera a menudo muy fácilmente. No existe informe alguno acerca de la regeneración eficaz directa de tejido de hoja de Allium aislado y sólo la regeneración con baja frecuencia de escamas gemelas, en las cuales un pequeño número de células en el lado abaxial de la hoja superior de la escama gemela se regenera (revisado por Eady 1995, actualizado en Eady y Hunger 2008) . Ha aparecido recientemente un informe acerca de la regeneración

50 de hojas de ajo por embriogénesis de callo y somática (Fereol et al. 2002) . La identificación en este trabajo de tipos de células de hojas inmaduras 'plásticas' procedentes de la base de la hoja de especies de Allium y su uso para transformación y regeneración es un descubrimiento inesperado y nuevo que puede mejorar notablemente la aplicación de biotecnología a las especies de Allium de cosecha.

Objeto de la invención

55 Es un objeto de la invención proporcionar un método de transformación de plantas Allium o proporcionar al menos al público una elección útil. 2

Sumario de la invención

La invención proporciona un método de transformación de plantas del género Allium que comprende inocular un tejido de hoja de una especie de Allium con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector o plásmido adecuado y regenerar luego selectivamente las células de Allium que han integrado la secuencia de DNA.

Específicamente, la presente invención proporciona un método de transformación de células de una especie de planta Allium con un polinucleótido de interés que comprende los pasos de:

(i) aislar una sección de hoja de la planta Allium a transformar;

(ii) co-cultivar la sección de hoja con Agrobacterium que contiene uno o más vectores adecuados que com

prenden el polinucleótido de interés durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la transferencia de la 10 secuencia de polinucleótidos de interés a una o más células de las hojas de la planta; y

(iii) transferir la sección de hoja a un medio de selección que permite la selección de células de la planta Allium transformadas.

Las piezas de hoja se transforman preferiblemente con un vector binario. Más preferiblemente, las piezas de hoja de una especie de Allium se inoculan antes de su diferenciación en cultivos de tejido. Sin embargo, los trozos de hoja

de una especie de Allium pueden inocularse inmediatamente después de su aislamiento. Preferiblemente se utilizan piezas de hojas inmaduras. Adicionalmente, el medio de selección incluye un agente para destruir selectivamente el Agrobacterium.

El método de acuerdo con la presente invención es adecuado para uso con cualquier planta Allium. Más específicamente la planta Allium es una cualquiera de Allium cepa, Allium fistulosum o Allium ampeloprasum, Allium ascaloni

cum, Allium schoenoprasum o Allium sativum.

Las células de Allium transformadas pueden citarse también para generar plantas enteras. Por consiguiente, el método de la presente invención puede comprender también el paso de regeneración de una planta a partir de las células transformadas.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona una planta Allium transformada por el método de acuerdo con

el método de la presente invención. La planta Allium puede transformarse con un polinucleótido de interés que confiere una ventaja agronómica. Por ejemplo: resistencia a herbicidas, tales como glifosato y/o fosfinotricina; resistencia a enfermedades fúngicas, tales como la pudrición blanca de Allium; resistencia a enfermedades víricas, tales como el Virus del Moteado Amarillo del Lirio o los virus responsables de la enfermedad del mosaico del ajo; resistencia a enfermedades bacterianas; resistencia... [Seguir leyendo]

1. Un método de transformación de células de una especie de planta Allium con un polinucleótido de interés, que comprende los pasos de:

(i) aislar una sección de hoja inmadura de la planta Allium a transformar;

(ii) co-cultivar la sección de hoja con Agrobacterium que contiene uno o más vectores adecuados que comprenden el polinucleótido de interés durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la transferencia de la secuencia de polinucleótidos de interés a una o más células de hoja de la planta; y

(iii) transferir la sección de hoja a un medio de selección que permite la selección de las células de la planta 10 Allium transformada.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más vectores es un vector binario.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el cual el medio de selección incluye un agente para destruir selectivamente el Agrobacterium.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la planta Allium es una

cualquiera de Allium cepa, Allium fistulosum o Allium ampeloprasum, Allium ascalonicum, Allium schoenoprasum o Allium sativum.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el polinucleótido de interés confiere una ventaja agronómica.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el polinucleótido de interés confiere 20 resistencia a:

(a) herbicidas que incluyen, pero sin carácter limitante, glifosato y fosfinotricina;

(b) enfermedad fúngica con inclusión, pero sin carácter limitante, de la pudrición blanca de Allium;

(c) virus con inclusión, pero sin carácter limitante, del Virus del Moteado Amarillo del Lirio y los virus responsables de la enfermedad del mosaico del ajo;

(d) enfermedades bacterianas; o

(e) plagas de insectos que incluyen, pero sin carácter limitante, la cresa de la cebolla y los trípidos.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el polinucleótido de interés confiere una modificación del camino del espigado y la floración.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el polinucleótido de interés afecta al 30 nivel, reconocimiento o actividad del agente hormonal de la floración.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el polinucleótido de interés confiere una ventaja de rasgo de calidad.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y 9, en el cual el polinucleótido de interés confiere sobreexpresión o silenciación de los genes del camino de la coloración o sus reguladores.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y 9, en el cual el polinucleótido de interés confiere:

(a) sobreexpresión o silenciación de los genes del camino del azufre o sus reguladores;

(b) la silenciación del gen lfs por el uso de sus secuencias de RNAi de LFS; o

(c) la sobreexpresión o silenciación de los genes del camino de los carbohidratos, o sus reguladores, con inclusión, pero sin carácter limitante, de sst1 o sst2.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente el paso de regenerar una planta a partir de las células transformadas.

FIGURA 7

FIGURA 11

Figura 14

FIGURA 15

FIGURA 16