TRANSFERENCIA OPTIMIZADA DE T-DNA Y VECTORES ASOCIADOS.

Transferencia optimizada de T-DNA y sus vectores asociados. Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Más particularmente, describe métodos para la incorporación de ADN exógeno al genoma de células eucariotas tales como células vegetales. Los aspectos concretos de la presente invención residen en el diseño de las repeticiones marginales que flanquean al ADN-T transferido mediante agrobacterias de manera que se reduce significativamente la ultralectura hacia el margen izquierdo del ADN- T y/o se puede eliminar fácilmente el ADN del esqueleto del vector integrado. De esta manera, se incrementa la frecuencia de obtención de células eucariotas transgénicas que contienen solamente el ADN-T. Antecedentes de la invención Se han obtenido variedades de plantas mejoradas mediante cruzamientos clásicos desde que el ser humano cambió la existencia nómada por un asentamiento permanente. En la historia más reciente, los científicos comenzaron a desentrañar el comportamiento del material genético durante los cruzamientos y los cultivadores de plantas pudieron beneficiarse, y aún se benefician, del conocimiento contenido en las leyes de Mendel que predicen la distribución de un rasgo genético dado en la descendencia de un cruzamiento. Con la llegada de la biología molecular de plantas, los cultivadores de plantas pueden insertar con una precisión cada vez mayor, nuevos genes quiméricos en el genoma de una planta. Actualmente se dispone de una diversidad de técnicas para intervenir en la transformación genética de plantas incluyendo la agrolística, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes y bombardeo con partículas recubiertas de ADN. Un sistema de transformación de plantas preferido y usado ampliamente hace uso de la bacteria del suelo Agrobacterium (Zupan y Zambryski 1995, Gelvin 1998a, Gheysen et al. 1998). Actualmente, Agrobacterium no sólo se usa para transformar plantas sino también para transformar levaduras, mohos y hongos filamentosos (Bundock et al. 1995, de Groot et al. 1998, Gouka et al. 1999, documento WO 98/45455). Además se ha demostrado que los componentes de la producción del ADN-T y la maquinaria de transferencia de Agrobacterium son útiles para importar ADN a los núcleos de células de mamífero, abriendo perspectivas para el uso de estos componentes en terapia génica (Ziemienowicz et al. 1999). Agrobacterium transfiere al núcleo de la célula eucariota todo el ADN localizado en el ADN-T. Este ADN-T es parte del plásmido Ti (en el caso de Agrobacterium tumefaciens) o del plásmido Ri (en el caso de A. rhizogenes) de tipo silvestre. El ADN-T de tipo silvestre lleva los genes que provocan, después de la integración en el genoma de la planta, tumores de agalla de corona o el síndrome de la raíz pilosa en caso de infección con A. tumefaciens o A. rhizogenes, respectivamente. También están localizados en los plásmidos Ti o Ri de tipo silvestre los genes vir (genes de virulencia) que se activan mediante compuestos fenólicos de la planta. Los productos de los genes vir son responsables de la transferencia del ADN- T al genoma eucariota. Cuando se pretende usar para transformación, el ADN-T se desactiva (es decir, se eliminan todos los genes que provocan enfermedades) y se suministran los genes vir en trans sobre un plásmido auxiliar (el ADN-T que engloba el gen o los genes heterólogos está entonces localizado sobre un segundo vector de transformación binario de la planta) o en cis en el caso de un vector de transformación de la planta co-integrado. Los genes heterólogos de interés se clonan entre las dos secuencias centrales de margen imperfectas del ADN-T de 22 pb (en el caso de plásmidos Ti de octopina) o de 25 pb (en el caso de plásmidos Ti de nopalina) que constituyen el margen derecho (RB) y el margen izquierdo (LB), que son los únicos elementos en cis necesarios para dirigir el procesamiento del ADN-T. Las secuencias centrales marginales del RB y del LB están organizadas como repeticiones imperfectas. Las proteínas VirD1 y VirD2 producen un corte de cadena sencilla entre la tercera y cuarta base en la cadena inferior de cada repetición marginal (Yanofsky et al. 1986). El aumento de los niveles de VirD1 y VirD2 potencia la producción de complejos de ADN-T dentro de Agrobacterium y da como resultado una mayor eficacia en la transformación de la planta (Wang et al. 1990). Durante muchos años se ha creído que solamente se transfería a la célula eucariota el ADN entre las repeticiones, el ADN-T, y no el ADN del vector externo al ADN-T. No obstante, una caracterización reciente y más detallada de los insertos de ADN en plantas transgénicas demuestra que también se integran en el genoma de la planta con mucha frecuencia secuencias del esqueleto del vector (Martineau et al. 1994, Ramanathan y Veluthambi 1995, Cluster et al. 1996, van der Graaff et al. 1996, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997, Wolters et al. 1998). Los autores de la presente invención han descubierto previamente que la frecuencia de integración de las secuencias del vector no está influenciada por las especies de plantas o el método de transformación usado. Esto es coherente con la visión de que la transferencia de secuencias del esqueleto del vector es la consecuencia de la ultralectura más allá del LB, un proceso que se produce dentro de las células de Agrobacterium y que seguramente esté determinado por factores dentro de estas células. No obstante, se debe advertir que otros han informado sobre la integración del esqueleto del vector en el 33% de los transformantes de Arabidopsis obtenidos mediante transformación radicular y en hasta el 62% de los transformantes obtenidos mediante infiltración por vacío (Wenck et al. 1997). Esto implica que el método de transformación usado podría ser otro factor que influye en la frecuencia de la integración del esqueleto del vector. Se ha notificado que la integración de secuencias del esqueleto del vector se produce en muchas especies de plantas incluyendo Petunia (Virts y Gelvin 1985, Cluster et al. 1996), Arabidopsis (van der Graaff et al. 1996, Wenck et al. 1997), tabaco (Ramanathan y Veluthambi 1995, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997) y patata (Wolters et 2 ES 2 335 614 T3 al. 1998). La integración del esqueleto del vector aparentemente es independiente del tipo de cepa de Agrobacterium usada para la transformación de la planta (Kononov et al. 1997). Los inventores han analizado previamente diferentes series de transformantes con respecto a la presencia de secuencias del esqueleto del vector mediante el uso de reacciones de PCR específicas y análisis de transferencia de ADN en gel. Se evaluaron tres métodos de transformación diferentes en dos especies de plantas diferentes, particularmente transformación radicular y folicular de Arabidopsis thaliana y transformación protoplástica y folicular de Nicotiana tabacum. Por último, se evaluó la influencia del tipo de replicón, los replicones ColE1 y pVS1. Los resultados demostraron que ni las especies de plantas ni el tipo de explante usado para la transformación, el tipo de replicón o la selección tienen una influencia fundamental sobre la frecuencia con la cual se producía la integración de las secuencias del vector. En el pasado se postuló que esta transferencia del ADN del vector que no pertenece al ADN-T podría ser el resultado de la ultralectura en el margen izquierdo, que impediría la terminación normal de la transferencia del ADN- T. Como alternativa, la transferencia de ADN podría comenzar en el margen izquierdo y proseguir hacia el margen derecho (Ramanathan y Veluthambi, 1995; van der Graaff et al., 1996). No obstante, en las plantas transgénicas descritas anteriormente se observó que muchas contenían secuencias del esqueleto del vector unidas al margen izquierdo así como uniones del vector con el margen derecho del ADN-T. Las transferencias de ADN en gel indican que en la mayoría de estas plantas se integra la secuencia completa del vector. Por tanto, se postuló que la integración en el genoma de la planta de secuencias completas del esqueleto del vector puede ser el resultado de una transferencia conjugativa iniciada en el margen derecho y seguida posteriormente con la copia en los márgenes izquierdo y derecho, denominada ultralectura. Este modelo implica que el margen izquierdo no se reconoce con frecuencia como un sitio de iniciación para la transferencia de ADN y que el margen derecho no se reconoce eficazmente como un sitio de terminación para la transferencia de ADN. Estas observaciones concuerdan con los resultados de trabajos previos que demuestran que la región del margen derecho es intrínsecamente más activa que la región del margen izquierdo en la promoción de la transformación del ADN-T (Jen y Chilton 1986a,b, Caplan et al. 1985). A partir de todos...

1. Vector de transformación de ADN-T que comprende ADN-T con márgenes de ADN-T flanqueantes a izquierda y derecha modificados, caracterizado porque el margen derecho de ADN-T modificado consiste en una región externa de margen derecho, una secuencia central del margen derecho y una región interna de margen derecho, y el margen izquierdo de ADN-T modificado consiste en (i) una repetición de los márgenes izquierdos del ADN-T en la que dicha repetición comprende al menos un margen izquierdo de ADN-T de tipo nopalina y al menos un margen izquierdo de ADN-T de tipo octopina, caracterizado adicionalmente porque dicho margen izquierdo de ADN-T modificado comprende al menos una secuencia central del margen izquierdo, o (ii) una sola secuencia central de margen izquierdo, una región externa de margen izquierdo y una región proximal de margen izquierdo de la región interna con una longitud preferible de 10 a 100 pb, caracterizada adicionalmente porque dicha región proximal de margen izquierdo de la región interna está enriquecida en el número de residuos de A y T, siendo el porcentaje de residuos AT del 60 al 85%. 2. Vector para la transformación mediada por Agrobacterium, para la transformación agrolística o para fines de terapia génica con márgenes de ADN-T modificados como se ha definido en la reivindicación 1, en el que dicho vector se escoge entre vectores de transformación binarios, vectores de transformación superbinarios, vectores de transformación co-integrados, vectores de transformación derivados de Ri y vectores portadores de ADN-T usados en transformación agrolística o terapia génica. 3. Procedimiento para la obtención de plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos transgénicos que consiste en una transformación mediada por Agrobacterium de dichas plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos con un vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2. 4. Procedimiento para prevenir la integración de secuencias del esqueleto del vector en una célula transformada mediante Agrobacterium, que comprende el uso de un vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2. 5. Procedimiento de la reivindicación 4 que comprende adicionalmente aumentar la producción de las proteínas VirD1 y/o VirD2 comprendidas dentro del complejo de corte de ADN-T. 6. Procedimiento de la reivindicación 5 que implica la integración de al menos una copia adicional del locus virD en el genoma o en una entidad extracromosómica de Agrobacterium. 7. Procedimiento de la reivindicación 6 en el que dicha copia adicional del locus virD se selecciona entre el locus virD de tipo octopina y el locus virD de tipo nopalina. 8. Procedimiento de transformación agrolística de una célula eucariota usando un vector de ADN-T de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 9. Célula hospedadora recombinante que contiene un vector según se define en las reivindicaciones 1 ó 2. 10. Célula hospedadora de la reivindicación 9 identificada como Agrobacterium tumefaciens. 11. Célula de planta o una planta transgénica, una parte transgénica de la misma o su descendencia transgénica, que comprende un ADN-T procedente del vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho ADN-T comprende una región proximal de margen izquierdo de la región interna con una longitud preferible de 10 a 100 pb, caracterizada adicionalmente porque dicha región proximal del margen izquierdo de la región interna está enriquecida en el número de residuos de A y T, siendo el porcentaje de residuos AT del 60 al 85%. 12. Levadura, moho u hongo filamentoso transgénico que comprende un ADN-T procedente del vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho ADN-T comprende una región proximal del margen izquierdo de la región interna con una longitud preferible de 10 a 100 pb, caracterizada adicionalmente porque dicha región proximal del margen izquierdo de la región interna está enriquecida en el número de residuos de A y T, siendo el porcentaje de residuos AT del 60 al 85%. 13. ADN-T procedente del vector de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho ADN-T comprende una región proximal del margen izquierdo de la región interna con una longitud preferible de 10 a 100 pb, caracterizado adicionalmente porque dicha región proximal del margen izquierdo de la región interna está enriquecida en el número de residuos de A y T, siendo el porcentaje de residuos AT del 60 al 85%. 32 ES 2 335 614 T3 33 ES 2 335 614 T3 34 ES 2 335 614 T3 ES 2 335 614 T3 36 ES 2 335 614 T3 37 ES 2 335 614 T3 38 <110> CropDesign N.V. ES 2 335 614 T3 LISTA DE SECUENCIAS <120> Transferencia optimizada de ADN-T y sus vectores <130> CROP-002-EP-DIV <150> EP 99870264.1 <151> 16-12-1999 <150> US 60/195.758 <151> 10-04-2000 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 44 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 1 tgatgctgac tggcaggata tataccgttg taatttgagc tcgt 44 <210> 2 <211> 44 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 2 gcggcagcgg cggcaggata tattcaattg taaatggctt catg 44 <210> 3 <211> 44 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 3 tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaa 44 <210> 4 <211> 44 <212> ADN <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 4 ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacg 44 1 <210> 5 <211> 74 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 5 <210> 6 <211> 74 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 6 <210> 7 <211> 106 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 7 <210> 8 <211> 106 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido ES 2 335 614 T3 2 <400> 8 <210> 9 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 9 ES 2 335 614 T3 ccggtggctc gagg 14 <210> 10 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 10 tcgacctcga gcca 14 3