Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes,

alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento. La presente invención protege el procedimiento para la producción de plantas transgénicas, así como las propias plantas, que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes (tales como polifenoles y carotenoides), alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento, mediante el incremento de la actividad UDP-glucosa:d-fructosa-2-glucosiltransferasa (UGFT) productora de UDPGlucosa en plantas. En esta invención queda demostrado que UGFT está implicada en la producción de un importante pool de UDPGlucosa necesario para la producción de formas glicosiladas de polifenoles y carotenoides, altamente estables y con alta capacidad antioxidante

Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento, así como a las propias plantas transgénicas. Por lo tanto, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la ingeniería genética, la fisiología vegetal, la tecnología de los alimentos y la nutracéutica.

Estado de la técnica

La UDP-glucosa:D-fructosa-2-glucosil transferasa (UGFT) juega un papel fundamental tanto en la tasa de utilización de los nutrientes como en la conversión de la sacarosa en almidón y polisacáridos de pared celular (1,2) (Figura 1). UGFT está altamente regulada y cataliza la producción de UDPGlucosa y fructosa a partir de la sacarosa y UDP (3-6).

UDPGlucosa es la molécula donadora de glucosa para las reacciones de transglicosilación implicadas en la biosíntesis de glicolípidos, glicoproteínas y polisacáridos de pared celular tales como celulosa y callosa (1,7-9). Además, ensayos llevados a cabo in vitro han demostrado que el UDPGlucosa actúa como donador de glucosa para las reacciones de glicosilación de sustancias antioxidantes tales como polifenoles y carotenoides. Estas reacciones son determinantes para la estabilidad, conjugación con otras moléculas y prevención de la oxidación de los polifenoles que dan lugar al empardecimiento ("browning effect") de las hortalizas (10). Polifenoles y carotenoides son los responsables de la coloración de flores, frutos y hojas senescentes, y además, protegen a la planta contra agentes microbianos y contra enzimas degradadores de pared celular (11). Además, estos compuestos poseen actividad antioxidante y anti-inflamatoria y son conocidos por sus propiedades contra el cáncer y el acúmulo de colesterol en sangre (12-15). Órganos tales como los tubérculos de patata se caracterizan por acumular grandes cantidades de polifenoles y carotenoides (16-18), y constituyen una fuente importante de sustancias antioxidantes en las dietas de numerosas sociedades (19).

Las reacciones de glicosilación de polifenoles a partir de UDPGlucosa tienen lugar en el citosol (20). A pesar de que UGFT es una fuente importante de UDPGlucosa citosólico y de que éste es importante en la producción y estabilidad de sustancias antioxidantes in vitro, hasta la fecha no existen trabajos en los que se describa que el incremento en la actividad UGFT productora de UDPGlucosa esté implicado en la producción y acúmulo de sustancias antioxidantes in vivo. Tampoco existen evidencias experimentales ni trabajos científicos que sugieran la implicación de la actividad UGFT productora de UDPGlucosa, en la producción de sustancias antioxidantes en la célula. Tampoco existen trabajos en los que se altere los niveles intracelulares de UDPGlucosa como estrategia para alterar los niveles de sustancias antioxidantes in vivo. En este sentido, la presente invención describe por primera vez la producción de plantas con (a) elevado contenido en UDPGlucosa, (b) alto contenido en polifenoles y carotenoides, (c) elevada capacidad antioxidante y (d) bajo empardecimiento (browning effect) como consecuencia de la actividad UGFT productora de UDPGlucosa. Con todo ello se demuestra que, tal y como se ilustra en la Figura 1, UGFT está implicado en la producción de UDPGlucosa necesario para la producción de polifenoles y carotenoides glicosilados altamente estables y con alta capacidad antioxidante.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento, mediante el incremento de la actividad UGFT productora de UDPGlucosa en plantas. Además la presente invención se refiere a las propias plantas transgénicas caracterizadas por dichas propiedades.

Los efectos técnicos mostrados en la presente invención son extrapolables a cualquier tipo de órgano de la planta tal como: tubérculos, hojas, frutos y semillas, así como a cualquier tipo de planta como por ejemplo: patata, tabaco, tomate, arroz, cebada, trigo y maíz. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conseguidos, tanto expresando constitutivamente UGFT bajo el control del promotor 35S, como expresando UGFT bajo el control de un promotor específico de tubérculo utilizado (promotor del gen de la patatina). Cabe decir que la expresión constitutiva fue particularmente preferida. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conseguidos tras sobre-expresar cualquier isoforma y secuencia de UGFT (siendo particularmente preferida la variante UGFTX de la isoforma UGFT4 de patata). Es decir, cualquier promotor expresable en plantas que produzca la sobre-expresión de UGFT, así como cual- quier isoforma de UGFT con actividad productora de UDPGlucosa, estarían comprendidos en la presente invención.

A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos:

• Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre (WT).

• Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma.

• Compuestos antioxidantes: Son sustancias capaces de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas. Se encargan de capturar los radicales libres producidos en las reacciones de oxidación propias del metabolismo. Estos compuestos son muy utilizados en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares y neurodegenerativas, además de cómo suplementos dietéticos, conservantes de alimentos, cosméticos y para la prevención de la degradación del caucho y la gasolina. En la presente invención los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

• Polifenoles: son sustancias químicas presentes en las plantas y caracterizadas por la presencia de más de un grupo fenol (grupo -OH unido a un anillo aromático) por molécula. La presencia de estos anillos fenólicos le confiere la capacidad de actuar como antioxidantes ya que pueden captar radicales de oxigeno.

• Carotenoides: son pigmentos orgánicos que se encuentran de forma natural en plantas y otros organismos fotosintéticos. La mayoría de los carotenoides son tetraterpenoides, compuestos de 40 átomos de carbono formados por ocho unidades isoprenoides y contienen anillos a uno o ambos extremos de la molécula. Pueden funcionar como antioxidantes, protegiendo frente a la auto-oxidación.

• Antocianos: son pigmentos orgánicos polifenólicos que proporcionan coloración a muchas plantas y en especial a muchas flores. Su estructura química consiste en un grupo flavilo formado por un anillo benzopirano unido a un anillo fenólico. Tienen propiedades antioxidantes evitando la producción de radicales libres.

• Sobre-expresión de la enzima UGFT productora de UDPGlucosa: se entiende por sobre-expresión de la enzima UGFT productora de UDPGlucosa cuando la actividad de dicha enzima es significativamente superior a la existente en plantas silvestres o controles (WT) cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo en la Figura 3 se observa que la actividad UGFT productora de UDPGlucosa en los tubérculos de las plantas de patata control (WT) es de 590-710 mili unidades (mU)/g (peso fresco), mientras que la actividad UGFT productora de UDPGlucosa en los tubérculos de plantas de patata que expresan constitutivamente UGFT es de 730-1300 mU/g peso fresco. Por lo tanto la presente invención, se refiere a la sobre-expresión de la enzima UGFT, a modo de ejemplo, cuando la producción de UDPGlucosa en los tubérculos de las plantas de patata es mayor a 710 mU/g (peso fresco) (Figura 3).

• Alto contenido en UDPGlucosa: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Figura...

1. Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas con alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento, en relación al fenotipo de la planta silvestre, que comprende la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que sobre-expresa la enzima UGFT.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 5851 que comprende el plásmido pBIN35S-UGFT-NOS.

4. Uso del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 5851 que comprende el plásmido pBIN35S-UGFT-NOS para la obtención de plantas transgénicas que presentan un alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento en relación al fenotipo de la planta silvestre.

5. Uso, según la reivindicación 4, caracterizado porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

6. Uso del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 5851 que comprende el plásmido pBIN35S-UGFT-NOS para la obtención de células vegetales transformadas que presentan alto contenido en compuestos antioxidantes y alta capacidad antioxidante en relación con las células sin transformar.

7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

8. Planta transgénica, transformada con un vector de expresión que sobre-expresa la enzima UGFT, caracterizada por presentar alto contenido en compuestos antioxidantes, alta capacidad antioxidante y resistencia al empardecimiento respecto a la planta silvestre no transformada.

9. Planta transgénica, según la reivindicación 8, caracterizada porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

10. Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 5851 que comprende el plásmido pBIN35S-UGFT-NOS.

11. Planta transgénica, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque se selecciona entre cualquiera de las siguientes especies: patata, arroz, tomate, maíz y cebada.

12. Célula vegetal transformada con un vector de expresión que sobre-expresa la enzima UGFT, caracterizada por presentar alto contenido en compuestos antioxidantes y alta capacidad antioxidante respecto a las células sin transformar.

13. Célula vegetal transformada, según la reivindicación 12, caracterizada porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

14. Célula vegetal transformada, según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizada porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 5851 que comprende el plásmido pBIN35S-UGFT-NOS.

15. Célula vegetal transformada según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque se selecciona entre cualquiera de las siguientes especies: patata, arroz, tomate, maíz y cebada.

16. Uso de las plantas transgénicas, de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para la obtención de altas concentraciones de UDPGlucosa y altos niveles de compuestos antioxidantes.

17. Uso según la reivindicación 16 caracterizado porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.

18. Uso de las células vegetales transformadas, de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, para la obtención de altas concentraciones de UDPGlucosa y altos niveles de compuestos antioxidantes.

19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque los compuestos antioxidantes se seleccionan entre polifenoles y carotenoides.