Procedimiento para seleccionar y producir una vid o componente de la vid transgénicos con aumento de resistencia a la enfermedad de arrepollado en comparación con una vid o un componente de la vid transgénicos,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) transformar una célula vegetal de uva con una molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva o fragmento de la misma que es capaz de expresarse en una orientación de sentido en dicha célula vegetal;

(b) regenerar una vid o componente de la vid transgénicos a partir de la célula vegetal; y

(c) seleccionar una vid o componente de la vid transgénicos basándose en su expresión de dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma en el que dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma expresa una proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma y es negativa para la expresión de dicha proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma tal como se detectó por inmunoanálisis con enzima ligada y en el que dicha expresión aumenta la resistencia a dicho arrepollado de la vid o un componente de la vid transgénicos en comparación con una vid o componente de la vid no transgénicos

Resistencia de la vid al nepovirus.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para seleccionar y producir una vid transgénica o un componente de la vid con aumento de la resistencia a una enfermedad de arrepollado.

El virus del arrepollado de la vid (GFLV) es un nepovirus de la uva, que es transmitido de planta a planta por el nemátodo, Xiphinema index. GFLV es el agente responsable del arrepollado de la vid, que se produce en todo el mundo. La enfermedad se denomina por el aspecto de la forma de hoja en abanico de las hojas infectadas por el GFLV. Es una de las enfermedades más dañinas y extendidas de la vid. Los síntomas de la infección por GFLV incluyen la morfología anómala del brote y las decoloraciones de las hojas, que conducen a un aspecto como de abanico (Agrios, Plant Pathology, 3^a Edición, Academic Press, 1998, págs. 687-688). Además, la producción del fruto de las viñas infectadas es baja, con vides que producen pequeñas ramas que tienen el conjunto del fruto anormal y la maduración. Por último, las vides infectadas degeneran y mueren.

Se cree que existe una variedad muy extendida de GFLV por la utilización del material de plantación infectado. Aunque la variedad de hospedador natural se cree que está restringida a la uva, el GFLV es también transmisible a una amplia variedad de especies herbáceas por inoculación de sabia con fricción. Chenopodium quinoa es una especie para diagnóstico útil para el virus. En general, las cepas de GFLV son antigénicamente uniformes y el diagnóstico por ELISA es un procedimiento habitual.

La estrategias actuales para controlar el arrepollado de la vid y otras enfermedades provocadas por nepovirus en los viñedos incluyen el control de nematodos (por ejemplo, la fumigación del suelo y la utilización de otros plaguicidas), rizomas de reproducción para resistencia a la alimentación de nematodos, vides de reproducción para la resistencia al GFLV y plantación de vides sin enfermedad certificadas.

Sumario de la invención

En general, la invención proporciona un procedimiento para producir y seleccionar una vid o un componente de la vid transgénicos con aumento de resistencia al arrepollado como se indica en la reivindicación 1. El procedimiento generalmente implica: (a) transformar una célula vegetal de uva con una molécula o fragmento de la misma de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva (por ejemplo, una molécula o fragmento de la misma de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva que tiene aproximadamente 50% o más de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 1) que es capaz de expresarse en una célula vegetal; (b) regenerar una vid o componente de la vid transgénicos procedente de la célula vegetal; y (c) seleccionar una vid o componente de la vid transgénicos que expresa la molécula de ácido nucleico o componente de la misma a un nivel que es negativo para la expresión de la proteína o fragmento de la misma de la cubierta de nepovirus de la uva como se detecta por ELISA, en el que la expresión aumenta la resistencia de la vid o un componente de la vid transgénicos al arrepollado en comparación con las plantas que expresan la molécula de ácido nucleico a alto nivel. La baja expresión de nivel del ARNm del nepovirus de la uva o de la propia proteína de la cubierta expresada en la planta transgénica se mide por ELISA así como la inoculación de las plantas transgénicas con el virus y la selección de las vides resistentes. En las formas de realización preferidas, la molécula o fragmento de la misma de ácido nucleico es codificada por un transgén hallado en la vid transgénica. La molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma se expresa como en una orientación de la cadena transcrita. Todavía en otras formas de realización preferidas, dichas moléculas o fragmento de las mismas de ácido nucleico de la proteína del revestimiento del nepovirus de la uva se expresa en la vid o un componente de la vid transgénicos.

Tal como se expuso anteriormente, la invención incluye también fragmentos de una molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva que facilita, cuando se expresa a un nivel que es negativo para la expresión de la proteína o un fragmento de la misma de la cubierta del nepovirus de la uva tal como se detecta por ELISA, un aumento de la resistencia de una vid o de un componente de la vid transgénica, a un arrepollado. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva descritas en la presente memoria o las partes de las mismas pueden expresarse en una planta para facilitar la resistencia a la enfermedad. Las secuencias que median un aumento de resistencia a un arrepollado se consideran útiles en la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento", tal como se aplica a las secuencias de una molécula de ácido nucleico, significa por lo menos 5 nucleótidos contiguos, preferentemente por lo menos 10 nucleótidos contiguos, más preferentemente por lo menos 20 a 30 nucleótidos contiguos y aún más preferentemente por lo menos 40 a 80 o más nucleótidos contiguos. Los fragmentos de una molécula de ácido nucleico de nepovirus de la uva puede producirse y, posteriormente, integrarse en un vector de expresión habitual (por ejemplo, los descritos en la presente memoria) según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

Preferentemente, la vid útil en la invención es un miembro del género Vitis; y el componente de la vid es un embrión somático, un esqueje, un rizoma o un bloque madre. El arrepollado es una enfermedad de arrepollado de la vid producida por un nepovirus de la uva. Todavía en otras formas de realización preferidas, el nepovirus de la uva es un virus de arrepollado de la vid o un virus del mosaico en arabis.

Los procedimientos y las secuencias de GFLV descritos en la presente memoria son útiles para proporcionar resistencia o tolerancia a la enfermedad o ambas en una variedad de vides (por ejemplo, Vitis spp., híbridos de Vitis spp. y todos los miembros de un subgénero Euvitis y Muscadinia), incluyendo cultivos por esqueje o rizoma. Los cultivos por esqueje ilustrativos incluyen, sin limitación, los que se denominan como uvas de mesa o en racimo y los utilizados en la producción de vino tales como Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Chardonnay (por ejemplo, CH 01, CH 02, CH Dijon), Merlot, Pinot Noir (PN, PN Dijon), Semillon, White Riesling, Lambrusco, Thompson Seedless, Autumn Seedless, Niagrara Seedless, y Seval Blanc. Los cultivos por rizoma que son útiles en la invención, incluyen, sin limitación, Vitis rupestris Constantia, Vitis rupestris St. George, Vitis california, Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris), 101-14 Millarder et de Grasset (Vitis riparia x rupestris), Teleki 5C (Vitis berlandieri x riparia), 3309 Courderc (Vitis riparia x rupestris), Riparia Gloire de Montpellier (Vitis riparia), 5BB Teleki (selección Kober, Vitis berlandieri x riparia), SO₄ (Vitis berlandieri x rupestris), 41B Millardet (Vitis vinífera x berlandieri), y 039-16 (Vitis vinífera x Muscadinia).

El término "Intraducible" significa una secuencia de ARNm que no está traducida en una proteína. Ejemplos de dichas secuencias intraducibles incluyen, sin limitación, las secuencias que incluyen un codón ATG de iniciación seguidas de una mutación de desplazamiento del marco modificada genéticamente y un codón de terminación para impedir la traducción del ARNm en una proteína. Los genes de la cubierta del nepovirus de la uva que expresan dichas secuencias de ARNm intraducibles pueden construirse según los procedimientos normalizados (por ejemplo, los descritos en la presente memoria).

El procedimiento para analizar la expresión de un gen de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva es la técnica inmunológica ELISA para la detección de una proteína.

La expresión "Sustancialmente idéntico" significa una molécula de proteína o ácido nucleico que presenta por lo menos 97%, y preferentemente 98%, o aún más preferentemente 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; SEC. ID. nº: 2) o en la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico mostradas en la Fig. 1; SEC. ID. nº:...

1. Procedimiento para seleccionar y producir una vid o componente de la vid transgénicos con aumento de resistencia a la enfermedad de arrepollado en comparación con una vid o un componente de la vid transgénicos, comprendiendo dicho procedimiento:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma está codificada por un transgén integrado en un genoma de vid transgénica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha vid es un miembro del género Vitis.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho componente de la vid es un embrión somático.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho componente de la vid es un esqueje.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho componente de la vid es un cultivo de rizoma.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho cultivo de rizoma se selecciona de entre el grupo constituido por Vitis rupestris St. George, Vitis california, Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris), 101-14 Millarder et de Grasset (Vitis riparia x rupestris), Teleki 5C (Vitis berlandieri x riparia), 3309 Courderc (Vitis riparia x rupestris), Riparia Gloire de Montpellier (Vitis riparia), 5BB Teleki (selección Kober, Vitis berlandieri x riparia), SO₄ (Vitis berlandieri x rupestris), 41B Millardet (Vitis vinifera x berlandieri), y 039-16 (Vitis vinífera x Muscadinia).

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva procede de un virus del arrepollado de la vid.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que comprende además una molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva o un fragmento de la misma que presenta aproximadamente el 50% o más de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 1.