COMPOSICIONES, KITS Y PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION Y MODULACION DE DIABETES TIPO I.

Un procedimiento para evaluar si un individuo sufre de la diabetes tipo I,

en el que el procedimiento comprende comparar:

a) el nivel de expresión de un marcador en una muestra de células NKT de un individuo, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

b) el nivel normal de expresión del marcador en una muestra de control de células NKT, en el que una diferencia significativa entre el nivel de expresión del marcador en la muestra de células NKT del individuo y el nivel normal indica que el individuo sufre de la diabetes tipo I

Composiciones, kits y procedimientos de identificación y modulación de diabetes tipo I.

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud Provisional de los EEUU No. 60/209,703, presentada el 5 de junio de 2000.

La diabetes mellitus es un síndrome con componentes metabólicos, vasculares y neuropáticos interrelacionados. El componente metabólico, caracterizado generalmente por hiperglicemia, comprende alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono, las grasas y las proteínas provocadas por la ausencia o una reducción marcada de la secreción de insulina y/o una acción ineficaz de la insulina. El componente vascular incluye anomalías en los vasos sanguíneos que producen complicaciones cardiovasculares, retinales y renales. Las anomalías en los sistemas nerviosos periférico y autónomo comprenden un tercer componente del síndrome diabético.

Existen dos tipos de la diabetes mellitus: tipo I y tipo II. A la diabetes tipo I también se la llama diabetes "insulino-dependiente", debido a que los individuos que sufren este trastorno no pueden sintetizar su propia insulina y por lo tanto deben inyectarse insulina periódicamente. Quienes sufren de la diabetes tipo II, por su parte, son capaces de sintetizar la insulina, pero esta insulina es insuficiente para sus necesidades o este no la utiliza eficazmente. La diabetes tipo II (diabetes no insulino-dependiente) generalmente se controla mediante medicación oral.

Al igual que muchas enfermedades autoinmunes, la diabetes mellitus tipo I (IDDM) es un trastorno con una etiología muy compleja, que se cree implica "desencadenantes" ambientales que interactúan con una susceptibilidad genética poligénica. La identificación más temprana de un locus genético que confiere susceptibilidad a la IDDM tuvo lugar hace unos treinta años, cuando se descubrió la asociación de ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con la diabetes (Eisenbarth (1986) N. Engl. J Med. 214(21): 1360-1368; Wicker et al. (1995) Annu. Rev. Immunol. 13: 179-200; y Todd et al. (1987) Nature 329: 599-604). Estudios epidemiológicos posteriores han demostrado concluyentemente que el riesgo de contraer diabetes está fuertemente relacionado con la herencia de ciertos alelos de MHC de clase II. Si bien el locus MHC es el factor de riesgo genético más significativo para la diabetes, representa menos del 50% de este riesgo genético, lo que indica claramente que los locus no MHC dispersados por el genoma también realizan una contribución fundamental a la susceptibilidad y gravedad de la enfermedad (Davies et al.) (1994) Nature 371: 130-136).

Hasta la fecha, los barridos genómicos exhaustivos han localizado 18 locus de susceptibilidad diferentes para la IDDM (Becker (1999) Diabetes 48(7): 1353-1358). Estos supuestos locus de susceptibilidad deben ser evaluados con cuidado, puesto que muchos de ellos poseen valores estadísticos significativos menores que el estándar común (logaritmo de impares [LOD=3) y solo una parte de ellos ha sido replicada. Curiosamente, 15 de los 18 locus candidatos se superponen con locus de susceptibilidad establecidos anteriormente para otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (SLE), la esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés), la artritis reumatoide, la espondilitis anquilosante y enfermedad celíaca (Becker (1999), Diabetes 48(7): 1353-1358). Si bien no es definitivo, este resultado podría sugerir que los locus de susceptibilidad candidatos pueden contener genes que tienen un papel fundamental en la función y regulación inmune normal. Sin embargo, la identificación de el/los gen(es) en los supuestos locus de susceptibilidad responsables de esta regulación inmune ha resultado ser mucho más difícil que la identificación de los propios locus. Cada uno de estos locus puede abarcar distancias genéticas enormes de hasta 10-30 cM de tamaño y pueden contener cientos, sino miles de genes (Becker (1999) Diabetes 48(7): 1353-1358), muchos de los cuales tienen una función no definida y pueden actuar en forma combinatoria.

En un abordaje de la identificación de la base molecular que subyace a la diabetes tipo I, complementario a los barridos genómicos, también se ha estudiado la participación de diferentes células inmunes en la enfermedad. Se sabe que las células T invariantes CD161⁺V214Ja281 (células NKT) son importantes en la regulación de la célula T auxiliar (Th) Th1/Th2 bias (Bendelac et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 535-562) y se ha demostrado que las células NKT están presentes en números reducidos y que su frecuencia se reduce aún más antes del comienzo de la enfermedad, en varios modelos murinos de autoinmunidad (Takeda y Dennert (1993) J. Exp. Med. 177: 155-164; Mieza et al. (1996) J. Immunol. 156: 4035-4040; y Baxter et al. (1997) Diabetes 46: 572-582). Cuando se transfirió esta población celular de donantes diabéticos no obesos o donantes diabéticos no obesos/V14Ja281-transgénicos a animales prediabéticos, los receptores estaban protegidos contra la diabetes (Baxter et al. (1997) Diabetes 46: 572-582; Lehuen et al. (1998) J. Exp. Med. 188:1831-1839). Esta transferencia de protección se inhibió significativamente mediante la administración conjunta de anticuerpos anti-IL-4 (Hammond et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 1047-1056).

Los seres humanos tienen una población de células T CD161⁺Va24JaQ homóloga invariante (es decir, sin adiciones de regiones N) cuyo elemento restrictivo, como el de las células murinas CD161⁺Va14Ja281, es la molécula no polimórfica de clase Ib CD1d (Exley et al. (1997) J. Exp. Med. 186(1): 109-20). Se ha demostrado que en cinco juegos de gemelos y trillizos monocigóticos discordantes para la diabetes tipo 1, las células T Va24JaQ estaban presentes en frecuencias significativamente más altas en los hermanos no diabéticos (Wilson et al. (1998) Nature 391(6663):177-81). Además, los clones de células Va24JaQ T de los hermanos no diabéticos segregaron tanto IL-4 como IFN-?, mientras que aquellos derivados de los hermanos diabéticos tenían una dificultad extrema en su capacidad para segregar IL-4.

En WO-A-93/19174 se divulga un marcador diferenciador de células T humano llamado "HT6", un anticuerpo dirigido a este marcador, así como un procedimiento para detectar la expresión de este marcador. HT6 es una proteína expresada por los linfocitos T humanos, que en particular ofrece la posibilidad de detectar células Ti/CD3+, CD4+ y/o CD45RA.

WILSON B ET AL: "Extreme Th1 bias of invariant Valpha 24Jalpha4T cells in type 1 diabetes" NATURE, vol. 391, 8 de enero 1998 (1998-01-08), páginas 177-81, y WO-A-99/34209 se dirigen a un nivel reducido de secreción de IL-4 de las células NKT diabéticas (activadas) en comparación con células no diabéticas (activadas), que se relaciona con el posible desarrollo de la diabetes tipo I.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para evaluar si un individuo sufre de la diabetes tipo I. Como se define en la reivindicación 1, en una realización preferida, el marcador corresponde a un polinucleótido transcripto o una parte de este, en el que el polinucleótido incluye el marcador. En una realización particularmente preferida el nivel de expresión del marcador en la muestra difiere con respecto al nivel normal de expresión del marcador en un individuo que no sufre de la diabetes tipo I, por un factor de al menos dos, y en una realización más preferida aún, los niveles de expresión difieren por un factor de al menos cinco.

Como se define en la reivindicación 18 la muestra incluye células NKT obtenidas del individuo. En otra realización preferida, el nivel de expresión del marcador en la muestra se evalúa detectando en la muestra la presencia de una proteína correspondiente al marcador. En una realización especialmente preferida, la presencia de la proteína se detecta utilizando un reactivo que específicamente se une con la proteína. En una realización más preferida aún, el reactivo se selecciona del grupo de reactivos que incluye un anticuerpo, un derivado de un anticuerpo, y un fragmento de un anticuerpo. En otra realización preferida, el nivel de expresión del marcador en la muestra se evalúa detectando en la muestra la presencia del polinucleótido transcripto o una parte del este, en el que el polinucleótido transcripto incluye el marcador. En una realización particularmente preferida, el polinucleótido transcripto es un ARNm o un ADNc. En otra...

1. Un procedimiento para evaluar si un individuo sufre de la diabetes tipo I, en el que el procedimiento comprende comparar:

a) el nivel de expresión de un marcador en una muestra de células NKT de un individuo, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

b) el nivel normal de expresión del marcador en una muestra de control de células NKT, en el que una diferencia significativa entre el nivel de expresión del marcador en la muestra de células NKT del individuo y el nivel normal indica que el individuo sufre de la diabetes tipo I.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el marcador corresponde a un polinucleótido transcripto o una parte del este, en el que el polinucleótido comprende el marcador.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células NKT se recogen del tejido pancreático.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células NKT se recogen del tejido sanguíneo.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión del marcador en la muestra de células NKT difiere del nivel normal de expresión del marcador en un individuo que no sufre de la diabetes tipo I, por un factor de al menos 2.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión del marcador en la muestra difiere del nivel normal de expresión del marcador en un individuo que no sufre de la diabetes tipo I, por un factor de al menos 5.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión del marcador en la muestra se evalúa detectando en la muestra la presencia de una proteína correspondiente al marcador.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la presencia de la proteína se detecta utilizando un reactivo que específicamente se une con la proteína.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el reactivo se selecciona del grupo de reactivos que consiste en un anticuerpo, un derivado de un anticuerpo y un fragmento de un anticuerpo.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión del marcador en la muestra se evalúa detectando en la muestra la presencia de un polinucleótido transcripto o una parte del este, en el que el polinucleótido transcripto comprende el marcador.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el polinucleótido transcripto es un ARNm.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el polinucleótido transcripto es un ADNc.

13. El procedimiento de la realización 10, en el que la etapa de detección comprende además amplificar el polinucleótido transcripto.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión del marcador en la muestra se evalúa detectando en la muestra la presencia del polinucleótido transcripto que se hibrida con el marcador o se hibrida con una parte de un polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende el marcador, en condiciones rigurosas de hibridación.

15. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende comparar:

a) el nivel de expresión en la muestra de células NKT de cada uno de los marcadores independientes seleccionados del grupo constituido por

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

b) el nivel normal de expresión de cada uno de los marcadores en muestras del mismo tipo obtenidas de individuos de control que no sufre de la diabetes tipo I, en el que el nivel de expresión de uno o más marcadores está significativamente alterado, con respecto a los niveles normales de expresión correspondientes de los marcadores, lo que indica que el individuo sufre de la diabetes tipo I.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el conjunto de marcadores comprende dos o más marcadores.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el conjunto de marcadores comprende al menos cinco de los marcadores.

18. Un procedimiento para controlar el avance de la diabetes tipo I en un individuo que comprende:

a) detectar en un muestra de células NKT de un individuo en un primer momento, la expresión de un marcador, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B y combinaciones de estos;

b) repetir la etapa a) en un momento posterior; y c) comparar el nivel de expresión detectado en los pasos a) y b), y a partir de ello controlar la progresión de la diabetes tipo I en el individuo.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el marcador corresponde a un polinucleótido transcripto o una parte del este, en el que el polinucleótido comprende el marcador.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las células NKT se recogen del tejido pancreático.

21. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las células NKT se recogen del tejido sanguíneo.

22. Un procedimiento para evaluar la eficacia de una terapia para inhibir la diabetes tipo I, en el que el procedimiento comprende comparar:

a) la expresión de un marcador en una primera muestra de células NKT obtenidas de un individuo antes de proporcionar al menos parte de la terapia al individuo, en el que el marcador se selecciona de un grupo constituido por

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

b) la expresión del marcador en una segunda muestra de células NKT obtenidas del individuo después de haberle proporcionado una parte de la terapia, en el que una disminución significativa en el nivel de expresión de un marcador en la segunda muestra, con respecto con la primera muestra, es un indicador de que la terapia es eficaz para inhibir la diabetes tipo I en un individuo.

23. Un procedimiento para evaluar la eficacia de un compuesto de prueba para inhibir la diabetes tipo I en un individuo, en el que el procedimiento comprende comparar:

a) la expresión de un marcador en una primera muestra de células NKT obtenidas de un individuo y expuestas o mantenidas en presencia del compuesto de prueba, en el que el marcador se selecciona de un grupo constituido por

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

b) la expresión del marcador en una segunda muestra de células NKT obtenidas del individuo, en el que la segunda muestra no está expuesta al compuesto de prueba, en el que una disminución significativa en el nivel de expresión de un marcador en la primera muestra, con respecto con la segunda muestra, es un indicador de que el compuesto de prueba es eficaz para inhibir la diabetes tipo I en un individuo.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la primera y segunda muestras son partes de una única muestra de células NKT obtenidas del individuo.

25. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la primera y segunda muestras son partes de muestras combinadas de células NKT obtenidas del individuo.

26. Un procedimiento para seleccionar una composición para inhibir la diabetes tipo I en un individuo en el que el procedimiento comprende:

a) mantener separadamente alícuotas de una muestra que comprende células NKT obtenidas de un individuo en presencia de un conjunto de composiciones de prueba;

b) comparar la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas, en el que el marcador se selecciona del grupo constituido por

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

c) seleccionar una de las composiciones de prueba que induce un nivel más bajo de expresión del marcador en la alícuota que contiene la composición de prueba, con respecto a otras composiciones de prueba.

27. Un procedimiento para evaluar el potencial de un compuesto de prueba para desencadenar la diabetes tipo I en un individuo, en el que el procedimiento comprende:

a) mantener alícuotas separadas de células NKT en presencia y ausencia del compuesto de prueba; y

b) comparar la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas, en el que el marcador se selecciona del grupo constituido por

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B, y

En el que un aumento significativo del nivel de expresión del marcador en la alícuota que se mantiene en presencia del compuesto de prueba, con respecto con la alícuota que se mantiene en ausencia del compuesto de prueba es una indicación de que el compuesto de prueba posee el potencial para desencadenar la diabetes tipo I en una célula.

28. El uso de un kit para realizar los procedimientos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 23, 26 y 27, en el que el kit comprende al menos un reactivo para evaluar la expresión de un marcador en una muestra de células NKT, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B.

29. El uso según la reivindicación 28, en el que el reactivo es una sonda de ácido nucleico que se une específicamente con un polinucleótido transcripto correspondiente a un marcador seleccionado del grupo que consiste en

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B.

30. El uso según la reivindicación 28, en el que el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente con una proteína correspondiente a un marcador seleccionado del grupo que consiste en

LT-ß, Semaphorin III, Frizzled, Flightless I hom., pp32 nuclear, PTP D1, RNP B5, RNP homólogo, TRAP-3, MLN62, IL-9R, CD37, EBI-1, LPAP, Calponin, GRK-6, TXK, BTF-3 hom., EIF-4B.