TIPIFICACION DE TOXICIDAD EMPLEANDO CELULAS MADRE HEPATICAS.

Un método de creación de un perfil molecular de una composición química,

que comprende los pasos de:

a) poner en contacto una población aislada de células madre hepáticas (LSCs) de mamífero con la composición química; y

b) registrar las alteraciones en la expresión de genes o la expresión de proteínas en las LSCs de mamífero en respuesta a la composición química para crear un perfil molecular de la composición química

Tipificación de toxicidad empleando células madre hepáticas.

Campo técnico

Esta invención proporciona métodos para identificación y caracterización de compuestos tóxicos así como para cribado de nuevos compuestos en cuanto a efectos tóxicos.

Técnica anterior

Los avances en los métodos de descubrimiento moderno de fármacos tales como los que utilizan ensayos de cribado de alta potencia de bibliotecas químicas combinatorias continúan proporcionando números sin precedentes de fármacos candidato para tratamiento de enfermedades. Sin embargo, el problema de la toxicidad de los fármacos para el sistema hospedador continúa siendo un paso importante limitador de la velocidad en la traducción de los fármacos candidato desde el laboratorio al escenario de atención sanitaria. Problemas similares de toxicidad dificultan asimismo el desarrollo de productos químicos industriales y domésticos. Además de resultar costosos y consumir tiempo, los ensayos de cribado toxicológicos disponibles actualmente fallan en cuanto a la detección de todas las toxicidades asociadas con la terapia humana. Por ejemplo, tantos como una tercera parte de todos los tratamientos terapéuticos humanos prospectivos fallan en la primera fase de las pruebas clínicas en humanos debido a toxicidad inesperada. Mejores medios de cribado de agentes terapéuticos potenciales respecto a toxicidad potencial podrían reducir el coste y la incertidumbre del desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y, al reducir la incertidumbre, podrían incentivar al sector privado a destinar recursos adicionales al desarrollo de fármacos.

Las alternativas disponibles actualmente a las líneas de células tradicionales "mono-informadoras" y al ensayo de la toxicidad en animales no satisfacen plenamente estas necesidades. Por ejemplo, Farr, Patente EE.UU. 5.811.231, proporciona métodos de identificación y caracterización de compuestos tóxicos por elección de promotores de estrés seleccionados y determinación del nivel de la transcripción de genes ligados a estos promotores en células de diversas líneas de células. Este método depende por tanto del grado en que tanto el promotor como las líneas de células sean representativos del efecto del agente potencialmente tóxico sobre el organismo de interés.

El uso de redes de hibridación de oligonucleótidos proporciona otra ruta para determinación de la toxicidad potencial de las composiciones químicas. La exposición de las células de un cultivo a una composición química, seguida por comparación del patrón de expresión de las células expuestas con el de las células expuestas a otros agentes químicos permite detectar patrones de expresión similares al del compuesto de test, y predecir así que las toxicidades de las composiciones químicas serán similares. Véase, v.g., Service, R., Science (1998), 282, 396-399. Estos métodos adolecen del hecho de que las líneas de células individuales pueden no ser plenamente representativas de la biología compleja de un organismo intacto. Además, incluso la repetición de los tests en múltiples líneas de células no reproduce o tiene en cuenta las interacciones complejas entre células y tejidos que ocurren en un organismo.

Se conocen también ensayos de toxicidad basados en células hepáticas. Por ejemplo, Maier describe el desarrollo de un test de toxicidad in vitro con cultivos de hepatocitos de rata recién aislados. Maier, P., Experientia (1988), 44 (10):807-817. Este test está basado en alteraciones patológicas de ploidía inducidas por fármacos en hepatocitos como indicadores de compuestos que interfieren con la diferenciación celular en el hígado. Sawai y Awata describen un método para cultivar células hepáticas que puede utilizarse para testar la toxicidad de sustancias de test. Sawai y Awata, Patente Japonesa 10179150. Takashina y Naoki describen células hepáticas subcultivables establecidas obtenidas por fusión de una cepa de células hepáticas subcultivable con un hepatocito que pueden utilizarse para tests de toxicidad. Takashina y Naoki, Patente Japonesa 06.319.535. De nuevo, los ensayos de toxicidad que utilizan líneas de células tales como éstas pueden no tener en cuenta plenamente la biología compleja de un organismo o tejido intacto, y pueden no abordar las contribuciones de las interacciones entre células y tejidos en la determinación de los efectos de toxicidad.

Lockhart et al. describen un método de cribado de un fármaco respecto a efectos deletéreos secundarios sobre una célula que utiliza perfiles de expresión de un grupo de genes conocidos. Lockhart et al., Patente EE.UU. 6033860. Este método evalúa las alteraciones en la expresión de 16 genes conocidos, y por consiguiente está limitado sólo a tipos de fármacos y tipos de toxicidad que alteran la expresión de un número muy pequeño de genes cuya identidad se conoce y cuyo nivel de expresión puede medirse específicamente.

Se conoce también un método para identificación o testado de la citotoxicidad de un agente basado en la expresión del citocromo P450. Harris et al., Patente EE.UU. 5660986. Este método está basado en el testado de la toxicidad de determinados agentes sobre líneas de células epiteliales bronquiales y hepáticas humanas que expresan el citocromo exógeno P450. Este método está limitado por su estrecho enfoque en cuanto a la expresión de un gen particular y su naturaleza como ensayo que está basado en líneas de células que no tienen en cuenta las complejas interacciones entre células y tejidos.

Debido en gran parte a que desempeña un papel vital en la destoxificación de sustancias venenosas en el cuerpo, el hígado es el sitio en el cual se manifiestan con mayores frecuencia y gravedad los efectos de toxicidad de las sustancias. Véase, v.g., Tabla 1. Por esta razón, podría esperarse que los ensayos de toxicidad que están enfocados fundamentalmente en los efectos de compuestos potencialmente tóxicos en células relacionadas con o que se encuentran en el hígado sean particularmente informativos.

Lo que se precisa en la técnica es un método de testado sistemático de composiciones químicas en cuanto a toxicidad potencial en un medio en el cual las células interaccionan con células de otros tipos y que sea lo más relevante posible para la o las dianas comunes de los efectos tóxicos. Se precisa adicionalmente un medio de hacer esto que sea relevante en cuanto al efecto de la composición sobre organismos o tejidos completos, sin la ramificación de coste, tiempo, y ética de los tests en animales y humanos. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Descripción de la invención

Esta invención proporciona nuevos métodos para evaluar la toxicidad de las composiciones químicas. En un grupo de realizaciones, la invención está dirigida a métodos de creación de un perfil molecular de una composición química, que comprende los pasos de a) poner en contacto una población aislada de células madre hepáticas (LSCs) de mamífero con la composición química; y b) registrar las alteraciones en la expresión de genes o la expresión de proteínas en las LSCs de mamífero en respuesta a la composición química para crear un perfil molecular de la composición química.

La invención materializa adicionalmente métodos de compilación de una biblioteca de perfiles moleculares de composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas, que comprenden los pasos de a) poner en contacto una población aislada de LSCs de mamífero con una composición química que presenta toxicidades predeterminadas; b) registrar las alteraciones en la expresión de los genes o la expresión de las proteínas en las LSCs de mamífero en respuesta a la composición química para crear un perfil molecular de la composición química; y c) recopilar una biblioteca de perfiles moleculares por repetición de los pasos a) y b) con al menos dos composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas. Las bibliotecas de perfiles moleculares recopiladas por los métodos de la invención pueden guardarse en dispositivos de almacenamiento adecuados, tales como discos duros de ordenador, discos compactos, casetes, discos flexibles y análogos. De modo general y preferiblemente, los dispositivos de almacenamiento adecuados almacenan dichos datos en forma legible por máquina (tal como una computadora).

Otra realización de la presente invención proporciona métodos para tipificar la toxicidad de una composición química de test por comparación de su perfil molecular en LSCs con el de una composición química identificada...

1. Un método de creación de un perfil molecular de una composición química, que comprende los pasos de:

a) poner en contacto una población aislada de células madre hepáticas (LSCs) de mamífero con la composición química; y

b) registrar las alteraciones en la expresión de genes o la expresión de proteínas en las LSCs de mamífero en respuesta a la composición química para crear un perfil molecular de la composición química.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las alteraciones en la expresión génica o la expresión de proteínas son detectadas por un identificador.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el identificador se selecciona de un agente fluorescente, colorimétrico, radiactivo, enzima, sustrato enzimático, análogo de nucleósido, magnético, vidrio, cuenta de látex, oro coloidal, y transpondedor electrónico.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el perfil molecular comprende alteraciones en la expresión génica.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las alteraciones en la expresión génica son detectadas por un ensayo de hibridación de nucleótidos.

6. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el perfil molecular comprende alteraciones en la expresión de proteínas.

7. El método de la reivindicación 6, en donde las alteraciones en la expresión de proteínas son detectadas por un ensayo de inmunoactividad.

8. El método de la reivindicación 6, en donde las alteraciones en la expresión de proteínas son detectadas por un ensayo de espectrometría de masas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde las LSCs son de origen humano.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde las LSCs son de mamíferos no humanos.

11. El método de la reivindicación 10, en donde los mamíferos no humanos son roedores.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición química se selecciona de agentes terapéuticos, neurotoxinas, toxinas hepáticas, toxinas de células hematopoyéticas, micotoxinas, carcinógenos, teratógenos o toxinas para uno o más órganos reproductivos.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la composición química se selecciona de productos agroquímicos, cosméticos y contaminantes ambientales.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la composición química es un agente terapéutico potencial o un cosmético candidato.

15. Un método de recopilación de una biblioteca de perfiles moleculares de composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas, que comprende los pasos de:

a) realización del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 con una composición química que presenta toxicidades predeterminadas; y

b) recopilación de una biblioteca de perfiles moleculares por repetición del paso a) con al menos dos composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas.

16. Un método de tipificación de la toxicidad de una composición química de test, que comprende los pasos de:

a) creación de un perfil molecular de la composición química de test de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; y

b) comparación del perfil molecular en el paso a) con el perfil molecular de una composición química que presenta toxicidades predeterminadas;

en donde el tipo de toxicidad de la composición química de test se determina por la comparación efectuada en el paso b).

17. El método de la reivindicación 16, en donde en el paso b) el perfil molecular se compara con una biblioteca compuesta de perfiles moleculares de composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas, comprendiendo la biblioteca compuesta los perfiles moleculares de al menos dos composiciones químicas y creándose dichos perfiles moleculares de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. El método de la reivindicación 17, que comprende adicionalmente clasificar la toxicidad de la composición química de test basada en la comparación del paso b).

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la composición química de test es conocida o desconocida.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas se seleccionan de agentes terapéuticos, neurotoxinas, toxinas renales, toxinas hepáticas, toxinas de células hematopoyéticas, y micotoxinas.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas se seleccionan de agentes que son tóxicos para las células de uno o más órganos reproductivos, agentes teratógenos y carcinógenos.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las composiciones químicas que presentan toxicidades predeterminadas se seleccionan de productos agroquímicos, cosméticos, y contaminantes ambientales.