SINTESIS IN VITRO MEJORADA DE PROTEINAS ACTIVAS QUE CONTIENEN ENLACES DISULFURO.

Método para la síntesis in vitro mejorada de polipéptidos plegados correctamente que comprenden uno o más enlaces disulfuro,

comprendiendo la mejora:

sintetizar dicho polipéptido en una mezcla de reacción que comprende un extracto biológico que ha sido tratado previamente con un agente desactivante de sulfhidrilo que alquila o acetila los grupos sulfhidrilo libres; y un tampón redox comprende uno o más de glutatión, ditiotreitol, ditioeritritol, ß-mercaptoetanol, tioglicolato y cisteína

Síntesis in vitro mejorada de proteínas activas que contienen enlaces disulfuro.

Antecedentes de la invención

Escherichia coli es un organismo ampliamente utilizado para la expresión de proteínas heterólogas. Crece fácilmente hasta una densidad celular elevada en sustratos económicos para proporcionar productividades volumétricas excelentes y económicas. Diversas técnicas genéticas bien establecidas y varios vectores de expresión justifican además el uso de Escherichia coli como huésped de producción. Sin embargo, es necesaria una velocidad elevada de síntesis de proteínas, pero ni mucho menos es suficiente, para la producción eficaz de biomoléculas activas. Con el fin de ser biológicamente activa, la cadena polipeptídica debe plegarse en la estructura tridimensional nativa correcta, incluyendo la formación apropiada de enlaces disulfuro.

En muchos casos, se ha observado que los polipéptidos recombinantes se secuestran en agregados refráctiles grandes conocidos como cuerpos de inclusión. Se pueden recuperar proteínas activas a partir de los cuerpos de inclusión a través de un ciclo de solubilización inducido por desnaturalizante de los agregados, seguido de la eliminación del desnaturalizante en condiciones que favorecen el plegamiento. Aunque la formación de cuerpos de inclusión puede facilitar algunas veces la purificación de proteínas expresadas; en la mayoría de ocasiones, el replegamiento de las proteínas agregadas sigue siendo un desafío.

Se han realizado varios intentos para mejorar el plegamiento de proteínas heterólogas en el citoplasma bacteriano. Además de los métodos tradicionales, incluyendo la disminución de la temperatura del cultivo, el creciente conocimiento del mecanismo y efectores del plegamiento de proteínas ha permitido establecer nuevas estrategias para resolver el problema de agregación.

Estudios in vitro han demostrado que, para la gran mayoría de los polipéptidos, el plegamiento es un proceso espontáneo dirigido por la secuencia de aminoácidos y las condiciones del disolvente. Aunque el estado nativo está termodinámicamente favorecido, la escala de tiempo para el plegamiento puede variar desde milisegundos a días. Las barreras cinéticas se introducen, por ejemplo, por la necesidad para la alineación de subunidades y subdominios. Particularmente con proteínas eucariotas, las reacciones covalentes deben tener lugar para que se formen proteínas correctamente plegadas. Estos últimos tipos de reacciones incluyen la formación de enlaces disulfuro, la isomerización cis/trans de la cadena polipeptídica alrededor de los enlaces peptídicos de prolina, el procesado de preproteínas y la ligación de grupos prostéticos. Estas limitaciones cinéticas dan lugar a la acumulación de intermedios parcialmente plegados, que contienen superficies "pegajosas" hidrofóbicas expuestas que favorecen la auto-asociación y formación de agregados.

La expresión de proteínas de mamífero es más complicada que las proteínas bacterianas, ya que la mayoría de ellas requieren enlaces disulfuro intramoleculares para su actividad. De este modo, se requieren efectores adicionales, tales como foldasas y un potencial redox adecuado, para conseguir sus estructuras nativas. Aunque es espacio periplásmico de Escherichia coli proporciona un entorno oxidante, así como proteínas plegables, tales como DsbA, B, C, y D; en muchos casos, la simple secreción de proteínas complejas en el espacio periplásmico no es suficiente para formar en laces disulfuro correctos.

Se ha observado que proteínas accesorias conocidas como foldasas y chaperones ayudan en el plegamiento correcto de proteínas in vivo. Las foldasas tienen una actividad catalítica que sirve para acelerar las etapas covalentes limitantes de la velocidad en el plegamiento. Los chaperones, por otro lado, realizan muchas funciones, la más importante de ellas es proporcionar un medio para que las proteínas nacientes se plieguen sin el proceso competitivo de auto-asociación. Además de los chaperones moleculares bien caracterizados, tales como las proteínas GroEL y DnaK, se han identificado un conjunto de proteínas citoplásmicas adicionales que afectan al plegamiento de proteínas heterólogas.

Tras el descubrimiento de numerosas foldasas bacterianas o eucariotas y sus funciones específicas en la oxidación e isomerización de enlaces disulfuro, se han realizado muchos intentos para utilizar estas proteínas en el espacio periplásmico o incluso en el citoplasma de Escherichia coli (véase, por ejemplo, Bessette et al. (1999)). Se ha observado que la coexpresión de chaperones moleculares resuelve parcialmente el problema de la formación de cuerpos de inclusión en la expresión de ciertas proteínas recombinantes (véase, por ejemplo, Richardson et al. (1998) Trends Biochem. Sci. 23: 138-143; y Bukau et al. (1998) Cell 92: 351-366).

Sin embargo, el efecto de los chaperones moleculares es bastante específico del producto y la coexpresión de cada chaperón molecular con las proteínas diana es a menudo dificultosa. Además, en algunos casos, la expresión de un chaperón molecular es perjudicial o incluso dañina para el crecimiento celular. A pesar de los recientes avances, la expresión de proteínas de mamífero correctamente plegadas en Escherichia coli aún sigue siendo un gran desafío. Esto es debido principalmente a las dificultades en el control de los parámetros clave para la formación de enlaces disulfuro incluyendo el potencial redox en el interior de las células.

Durante varias décadas, la síntesis de proteínas in vitro ha servido como una herramienta eficaz para la expresión a escala de laboratorio de materiales genéticos clonados o sintetizados. En los últimos años, se ha considerado la síntesis de proteínas in vitro como una alternativa a la tecnología convencional de ADN recombinante debido a las desventajas asociadas con la expresión celular. In vivo, las proteínas se pueden degradar o modificar mediante diversas enzimas sintetizadas con el crecimiento de la célula, y, después de la síntesis, se pueden modificar mediante procesado post-traduccional, tal como glicosilación, desamidación u oxidación. Además, muchos productos inhiben procesos metabólicos y su síntesis debe competir con otros procesos celulares requeridos para reproducir la célula y para proteger su información genética.

Debido a que está esencialmente libre de la regulación celular de la expresión génica, la síntesis de proteínas in vitro presenta ventajas en la producción de proteínas citotóxicas, inestables o insolubles. La sobreproducción de proteínas más allá de una concentración predeterminada puede ser difícil de obtener in vivo, ya que los niveles de expresión son regulados por la concentración de producto. La concentración de proteína acumulada en la célula afecta en general a la viabilidad celular, de manera que la sobreproducción de la proteína deseada es difícil de obtener. En un proceso de aislamiento y purificación, muchos tipos de proteína son insolubles o inestables, y son degradadas por proteasas intracelulares o agregadas en cuerpos de inclusión, de manera que la tasa de pérdida es elevada.

La síntesis in vitro supera muchos de estos problemas (véase Kim y Swartz (1999) Biotechnol. Bioeng. 66: 180-188; y Kim y Swartz (2000) Biotechnol. Prog. 16: 385-390). Además, a través de la expresión simultánea y rápida de varias proteínas en una configuración múltiple, esta tecnología puede proporcionar una herramienta valiosa para el desarrollo de arrays combinatorios para la investigación y el cribado de proteínas. Además, se pueden incorporar de manera eficaz varios tipos de aminoácidos no naturales en proteínas con objetivos específicos (Noren et al. (1989) Science 244: 182-188).

Merk et al., 1999, J. Biochem., Vol. 125, pág. 328-333, describe la síntesis de dos anticuerpos anti-lisozima de cadena única en un sistema de expresión de E. coli libre de células en presencia de glutatión reducido y oxidado, proteína disulfuro isomerasa (PDI) y chaperones.

Qu y Green, 1995, DNA and Cell Biology, Vol. 14, No. 9, pág. 741-751, describe el plegamiento y ensamblaje de una molécula MHC de clase II en un sistema libre de células.

Ryabova et al., 1997, Nature Biotech., Vol. 15, pág. 79-84, describe la producción de fragmentos scFv funcionales en un sistema de traducción libre de células de E. coli que incluye proteína disulfuro isomerasa...

1. Método para la síntesis in vitro mejorada de polipéptidos plegados correctamente que comprenden uno o más enlaces disulfuro, comprendiendo la mejora:

sintetizar dicho polipéptido en una mezcla de reacción que comprende un extracto biológico que ha sido tratado previamente con un agente desactivante de sulfhidrilo que alquila o acetila los grupos sulfhidrilo libres; y un tampón redox comprende uno o más de glutatión, ditiotreitol, ditioeritritol, ß-mercaptoetanol, tioglicolato y cisteína.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho agente desactivante de sulfhidrilo se selecciona del grupo que consiste en yodoacetamida, N-etil maleimida, yodoacetato, y N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etilen diamina.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho agente desactivante de sulfhidrilo es yodoacetamida.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho tampón redox comprende una mezcla de glutatión oxidado y reducido.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha mezcla se encuentra en una proporción de 4:1 de oxidado con respecto a reducido.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho extracto biológico deriva de una célula bacteriana que ha sido modificada genéticamente para desactivar una o más enzimas reductoras.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha una o más enzimas incluyen tioredoxin reductasa y glutatión reductasa.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de reacción comprende además una o más enzimas que mejoran el plegamiento de polipéptidos o la generación de enlaces disulfuro.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha una o más enzimas que mejoran el plegamiento de polipéptidos o la generación de enlaces di sulfuro son enzimas foldasas.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha enzima foldasa se selecciona del grupo que consiste en DsbA, B, C, D, PDI, GroEL/ES, DnaK, DnaJ, GrpE, BIP y ciclofilinas, tales como PPI.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha foldasa es DsbC.

12. Método según la reivindicación 10, en el que dicha foldasa es PDI.