Una región de control de genes sintética que comprende una secuencia reguladora de genes sintética de una cepa de levadura y un promotor de una cepa de hongo filamentoso localizado cadena abajo de la secuencia reguladora de genes sintética;

en la que el promotor puede reconocerse por los factores de transcripción generales y la ARN polimerasa de la cepa de levadura; en la que la secuencia reguladora de genes sintética es capaz de regular la transcripción iniciada por un promotor de hongo filamentoso en la cepa de levadura

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del panadero, se usa ampliamente como huésped para la expresión de una diversidad de polipéptidos heterólogos. Se han expresado muchas proteínas diferentes de una diversidad de especies en S. cerevisiae, algunas a niveles de >10% de la proteína celular total. Típicamente, la expresión se ha mediado por un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica el polipéptido heterólogo y la región de control del gen que controla expresiones de genes en S. cerevisiae así como otras secuencias necesarias para la sección y amplificación del plásmido tanto en S. cerevisiae como en Escherichia coli. Como alternativa, también es posible integrar la secuencia codificante y la región de control del gen en un cromosoma de S. cerevisiae y conseguir un alto nivel de expresión.

Las regiones de control de genes utilizadas en la expresión de polipéptidos heterólogos en S. cerevisiae típicamente son las que se producen de forma natural en S. cerevisiae, por ejemplo, la región de control de genes para la expresión de los genes divergentes GAL1 y GAL10. Por el contrario, se ha descubierto que, generalmente, las regiones de control de genes heterólogas, cuando se usan en células de S. cerevisiae, son inactivas o conducen a un inicio de la transcripción aberrante. Se ha propuesto que el uso de regiones de control de genes de S. cerevisiae es esencial para la expresión eficaz de genes heterólogos en células de

S. cerevisiae. (Romanos y col., YEAST 8: 423-488 (1992)).

El documento US-A-5407822 (Sanofi) desvela una secuencia descrita como un “promotor artificial” que contiene las secuencias de activación cadena arriba UAS1 y UAS2 del promotor del gen GAL7 de S. cerevisiae fusionadas al componente TATA y la región de inicio de la transcripción del promotor de ADH2 de S. cerevisiae. El documento EP-A-0258067 (Delta Biotechnology Limited) desvela una secuencia descrita como un promotor híbrido de levadura que contiene la secuencia de activación cadena arriba del promotor de GAL1/GAL10 (“GAL10UAS”) y la región 5' no codificante del gen PGK.

Las referencias citadas en el presente documento no se reconocen como técnica anterior para la invención reivindicada. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una región de control de genes sintética que comprende una secuencia reguladora de genes de una cepa de levadura y un promotor de una cepa de hongo filamentoso localizado cadena abajo de la secuencia reguladora de genes. El promotor de hongo filamentoso puede reconocerse por los factores de transcripción generales y la ARN polimerasa de la cepa de levadura. La secuencia reguladora de genes sintética puede regular la transcripción iniciada por el promotor de hongo filamentoso en la cepa de levadura.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la cepa de levadura se selecciona entre un grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y Yarrowia lipolytica. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae. De acuerdo con una realización alternativa de la presente invención, la cepa de levadura es Pichia pastoris.

La cepa de hongo filamentoso puede seleccionarse entre el grupo que consiste en Ustilago maydis, Aspergillus nidulans y Penicillium purpurogenum. El promotor de hongo filamentoso puede seleccionarse entre el grupo que consiste en los promotores del gen DMP1 de Ustilago maydis, el gen ArgB de Aspergillus nidulans y el gen XynA de Penicillium purpurogenum.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el sitio de unión es para un activador de genes de la cepa de levadura. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el sitio de unión es un sitio de unión para la proteína GAL4 de S. cerevisiae. De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el sitio de unión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 10, 11, 12 y 15, sitios de unión a GAL4 sintéticos.

La secuencia reguladora de genes puede comprender además un sitio de unión para un represor de genes de la cepa de levadura. De acuerdo con una realización de la presente invención, el sitio de unión para un represor de genes es un sitio de unión para la proteína MIG1 de S. cerevisiae. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el sitio de unión para la proteína MIG1 comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 18, 19 y 20.

De acuerdo con una realización preferida, la región de control de genes sintética puede comprender una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 21, 22, 23, 24, 25 y 26.

La presente invención proporciona vectores de expresión de ADN que comprenden la región de control de genes sintética, una secuencia codificante que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido bajo el control de la región de control, y un marcador de selección de levaduras. La secuencia codificante puede codificar una secuencia de aminoácidos eucariota, procariota o viral. Si la cepa de levadura es S. cerevisiae, el marcador de selección puede seleccionarse entre el grupo que consiste en LEU2, TRP1, URA3 e HIS3.

El vector de expresión de ADN puede comprender además una secuencia señal de

poliadenilación localizada cadena abajo de la secuencia codificante. El vector de expresión de ADN puede comprender además un terminador de la transcripción localizado cadena abajo de la secuencia codificante. El vector de expresión de ADN puede comprender además un origen de replicación de levadura, tal como uno basado en la secuencia de ADN de 2 micrómetros de

S. cerevisiae. El vector de expresión de ADN puede comprender además un origen de replicación bacteriano.

La presente invención proporciona además una cepa de levadura que contiene el vector de expresión de ADN. La cepa de levadura puede seleccionarse entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y Yarrowia lipolytica.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes tras las descripciones adicionales proporcionadas en el presente documento, incluyendo los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y la metodología útil para poner en práctica la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. Basándose en la presente revelación, el experto en la materia puede identificar y emplear otros componentes y metodologías útiles para poner en práctica la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Los promotores de hongos filamentosos. Posible caja TATA, sitio de inicio de la transcripción indicado subrayado (en forma de onda). El supuesto sitio de unión a MIG1 está subrayado (línea discontinua). Figura 1A: secuencia promotora de XynA truncada (SEC ID Nº: 1). Figura 1B: secuencia promotora de DPM1 (SEC ID Nº: 2). Figura 1C: secuencia promotora de ArgB (SEC ID Nº: 3). Figura 2: regiones de control de genes sintéticas que comprenden el promotor de XynA truncado y una región reguladora de genes. Los supuestos sitios de unión a la proteína GAL4 están subrayados. Los supuestos sitios de unión a la proteína MIG1 están subrayados (línea discontinua). Las Figuras 2A-2F son las secuencias de ADN de las regiones reguladoras de genes sintéticas. Figura 2A: EE2-XynA (SEC ID Nº: 21). Figura 2B: EE21-XynA (SEC ID Nº: 22). Figura 2C: EE22-XynA (SEC ID Nº: 23). Figura 2D: EE24-XynA (SEC ID Nº: 24). Figura 2E: EE25-XynA (SEC ID Nº: 25). Figura 2F: EE26-XynA (SEC ID Nº: 26). Figura 3. La expresión de un polipéptido heterólogo en S. cerevisiae, dirigida por diversas

regiones de control de genes sintéticas y la región de control de los genes GAL1-GAL10

natural de levadura, respectivamente. Las calles 2-5 son muestras de células de levadura

inducidas con galactosa. Las calles 6-9 son muestras de células de levadura cultivadas en

presencia de glucosa y no inducidas con galactosa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se ha analizado anteriormente, las regiones de control de genes que se usan ampliamente en la expresión de proteínas heterólogas en levadura son típicamente las que se producen de forma natural en S....

1. Una región de control de genes sintética que comprende una secuencia reguladora de genes sintética de una cepa de levadura y un promotor de una cepa de hongo filamentoso localizado cadena abajo de la secuencia reguladora de genes sintética; en la que el promotor puede reconocerse por los factores de transcripción generales y la ARN polimerasa de la cepa de levadura;

en la que la secuencia reguladora de genes sintética es capaz de regular la transcripción iniciada por un promotor de hongo filamentoso en la cepa de levadura.

2. La región de control de la reivindicación 1, en la que la secuencia reguladora de genes sintética comprende un sitio de unión para una proteína reguladora de genes, sin que dicho sitio de unión sea una secuencia en las regiones reguladoras de genes naturales de la cepa de levadura.

3. La región de control de la reivindicación 1 ó 2, en la que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha o Yarrowia lipolytica.

4. La región de control de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que la cepa de hongo filamentoso se selecciona entre el grupo que consiste en Ustilago maydis, Aspergillus nidulans, y Penicillium purpurogenum.

5. La región de control de la reivindicación 4, en la que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotores del gen XynA de Penicillium purpurogenum, el gen de DPMJ de Ustilago maydis y el gen ArgB de Aspergillus nidulans.

6. La región de control de la reivindicación 5, en la que el promotor es la SEC ID Nº: 1.

7. La región de control de cualquier reivindicación anterior, en la que la secuencia reguladora de genes comprende un sitio de unión para un activador de genes de la cepa de levadura.

8. La región de control de la reivindicación 7, en la que el sitio de unión es un sitio de unión para la proteína GAL4 de S. cerevisiae.

9. La región de control de la reivindicación 8, en la que el sitio de unión comprende una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 10, 11, 12, y

15.

10. La región de control de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia reguladora de genes comprende un sitio de unión para un represor de genes de la cepa de levadura.

11. La región de control de la reivindicación 7, en la que la secuencia reguladora de genes comprende además un sitio de unión para un represor de genes.

12. La región de control de la reivindicación 11, en la que la secuencia reguladora de genes comprende además un sitio de unión para la proteína MIG1 de S. cerevisiae.

13. La región de control de la reivindicación 12, en la que el sitio de unión para la proteína MIGI comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 18, 19, y 20.

14. La región de control de la reivindicación 1, en la que la región de control de genes sintética comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 21, 22, 23, 24, 25, y 26.

15. Un vector de expresión de ADN que comprende una región de control de genes sintética de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14; una secuencia codificante que codifica una proteína, polipéptido o péptido bajo el control de la región de control, y un marcador de selección de levadura.

16. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 15, que comprende además una secuencia señal de poliadenilación localizada cadena abajo de la secuencia codificante.

17. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 15, que comprende además un terminador de la transcripción localizado cadena abajo de la secuencia codificante.

18. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 15, 16 ó 17, en el que el marcador de selección de levadura es un marcador de selección de S. cerevisiae.

19. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 18, en el que el marcador de selección de S. cerevisiae está seleccionado entre el grupo que consiste en LEU2, TRP1, URA3 y HIS3.

20. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 1, que comprende además un origen de replicación de S. cerevisiae.

21. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 20, en el que el origen de replicación de S. cerevisiae se basa en la secuencia de ADN de 2 micrómetros de S. cerevisiae.

22. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 15, que comprende además un origen de replicación bacteriano.

23. Una cepa de levadura que comprende un vector de expresión de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15-22.

24. La cepa de levadura de la reivindicación 23, en la que la cepa de levadura está seleccionada entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y Yarrowia lipolytica.

25. La cepa de levadura de la reivindicación 23, en la que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

26. Un procedimiento para producir una proteína, polipéptido o péptido recombinante que comprende expresar la secuencia codificante de la cepa de levadura de la reivindicación 23.