Una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T

La presente invención se refiere a proteínas portadoras de poliepítopos. Cuando se conjugan con polisacáridos capsulares, estas proteínas portadoras son útiles como componentes de vacunas que son capaces de estimular una respuesta inmune de linfocitos T-dependientes particularmente, las proteínas de la presente invención se pueden usar para conferir protección frente a la infección procedente de bacterias encapsuladas en niños de edades comprendidas entre los 3 meses y aproximadamente los 2 años.

Bacterias encapsuladas tales como Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae constituyen una causa significativa de morbilidad y mortalidad en neonatos y niños en todo el mundo (Tunkel y Scheld, 1993). En los países en desarrollo, alrededor de un millón de niños mueren cada año debido exclusivamente a pulmonía. Además, incluso en países desarrollados, el aumento del fenómeno de resistencia a los antibióticos significa que existe una gran necesidad de mejorar las vacunas existentes.

La cápsula constituida por polisacáridos de H. influenzae, N. meningitidis y S. pneumoniae representa un factor de virulencia principal en la colonización nasofaríngea y la invasión sistémica por bacterias encapsuladas (Moxon y Kroll, 1990). Por consiguiente, la mayor parte de la investigación dirigida hacia el hallazgo de inmunógenos protectores se ha centrado en los polisacáridos capsulares. El hallazgo de que estos polisacáridos eran capaces de estimular la formación de anticuerpos protectores condujo al desarrollo de numerosas vacunas que han sido eficaces en la protección de adultos contra la enfermedad (Andreoni y col. 1993; Goldblatt y col. 1992).

El problema con las vacunas de polisacáridos capsulares desarrolladas hasta la fecha es que adolecen de una incapacidad inherente de proteger a niños menores de dos años de edad de la enfermedad (Holmes y Granoff 1992). Esto es un inconveniente significativo cuando se aprecia que esta población de niños tiene un riesgo más elevado de infección. Se cree que el fracaso en el bloqueo de la infección deriva de la reacción inmune de los linfocitos T de tipo independiente (TI) que es la única respuesta de anticuerpos utilizada por el cuerpo frente a los antígenos polisacáridos. Este tipo de respuesta no implica moléculas de restricción MHC de Clase II para la presentación de los linfocitos T: como consecuencia, se evita la ayuda de los linfocitos T. Aunque la respuesta TI funciona bien en adultos, está inactivada en muchos niños pequeños debido a una combinación de factores tales como la inmadurez funcional de las células B, la inactivación de la señalización mediada por los receptores de las células B y la debilidad de las células B en respuesta a la estimulación por el antígeno

Para superar este inconveniente, se están estudiando actualmente dos enfoques concretos de vacuna. El primero es el desarrollo de vacunas antiidiotípicas que contienen péptidos que mimetizan idiotipos de carbohidratos (McNamara 1984; Agadjanyan, 1997). El segundo enfoque implica vacunas conjugadas que se diseñan para transformar antígenos polisacáridos de linfocitos T independientes (TI) en antígenos T dependientes (TD) mediante el enlace covalente del polisacárido a un péptido portador.

Las vacunas conjugadas de H. influenzae de tipo B (Hib) representan un ejemplo sobresaliente del desarrollo de otras vacunas frente a infecciones que son debidas a bacterias encapsuladas. De hecho, la meningitis y otras infecciones producidas por Hib han disminuido drásticamente en países donde se ha conseguido la vacunación generalizada con conjugados de Hib (Robins, 1996). Puede ser posible la eliminación completa del patógeno, pero depende de diversos factores, entre los que se incluyen una mejora adicional de las vacunas existentes (Liptak, 1997).

Se han seleccionado los toxoides de los antígenos del tétanos y la difteria procedentes de vacunas pediátricas ampliamente distribuidas como proteínas portadoras con el objetivo de aprovechar una población ya estimulada en el momento de la inyección de la vacuna conjugada. La vacunación previa con vacunas pediátricas de difteria-tétanos (DT) o difteria-tétanos-pertussis (DTP) significa que se puede aprovechar en la actualidad el estímulo del portador para potenciar la respuesta inmune a los conjugados polisacáridos.

Se han producido satisfactoriamente muchas de dichas vacunas y han sido eficaces en la reducción del número de muertes producidas por estos patógenos. Los portadores usados en estas vacunas son antígenos grandes tales como el toxoide del tétanos, la toxina del mutante CRM197 de la difteria no tóxica y el complejo de proteínas de la membrana externa del grupo B de N. meningitidis (OMPC). Sin embargo, en el futuro, se piensa que a medida que aumente el número de vacunas conjugadas que contengan las mismas proteínas portadoras, es probable que llegue a ser un problema la supresión de las respuestas inmunes de los anticuerpos ya existentes al portador.

Se está dirigiendo ahora la mayor parte de la investigación al desarrollo de moléculas portadoras mejoradas que contengan péptidos portadores que comprendan epítopos CD4 de los linfocitos T cooperadores (Th), pero que no posean funciones supresoras de los linfocitos T (Ts) (Etlinger y col. 1990). Los péptidos que retienen únicamente funciones cooperadoras (epítopos CD4+) son más adecuados como portadores, debido a que su efecto es suficiente para inducir el linfocito T cooperador, pero el portador es lo suficientemente pequeño para limitar o evitar completamente la producción de anticuerpos dirigidos contra el portador.

Varias publicaciones demuestran la capacidad de dichos péptidos de conferir linfocitos T cooperadores a haptenos cuando se unen a los anteriores de forma covalente (Etlinger, 1990; Valmori 1992; Sadd 1992; Kumar 1992; Kaliyaperumal, 1995; De Velasco, 1995 y Bixler 1989).

Sin embargo, hasta la fecha, estas publicaciones no han dado como resultado el desarrollo de vacunas eficaces. Sigue existiendo de esta manera una gran necesidad de desarrollo de nuevas estrategias para mejora de vacunas que sean eficaces para combatir enfermedades producidas por bacterias encapsuladas en niños y niños pequeños.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T. Preferiblemente, la proteína portadora está conjugada con un polisacárido. Estos compuestos son útiles como compuestos inmunógenos que pueden a la vez ser útiles como componentes de vacunas protectoras frente a enfermedades producidas por bacterias patógenas.

Una proteína portadora es una entidad polipeptídica antigénica que induce la formación de anticuerpos dirigidos contra un antígeno conjugado con ésta por el sistema inmune de un organismo en el cual se introduce el conjugado del portador-antígeno. La necesidad de usar proteínas portadoras es el resultado del hecho de que aunque muchos epítopos cortos son protectores, son poco inmunógenos. Esto niega la utilidad de estos epítopos en la generación de nuevas vacunas eficaces. Conjugando una proteína portadora inmunógena con una molécula que no es inmunógena, es posible conferir la elevada inmunogenicidad de la proteína portadora a la molécula conjugada. Dichas moléculas conjugadas estimulan la generación de una respuesta inmune frente a la parte no inmunógena de la molécula conjugada y de esta manera se han usado eficazmente en vacunas que protegen frente a patógenos para los cuales no podría generarse de otra forma inmunidad protectora.

Por tanto, se han usado históricamente proteínas muy inmunógenas (tales como el toxoide del tétanos) como portadoras con el fin de inducir una respuesta de los linfocitos Th que proporcionan ayuda a los linfocitos B para la producción de anticuerpos dirigidos contra epítopos no inmunógenos. Sin embargo, no se ha conseguido generalmente efectividad global con esta solución, debido a que la respuesta del anticuerpo a un hapteno (el epítopo) acoplado a una proteína portadora se puede inhibir cuando el hospedador receptor se ha inmunizado previamente con la proteína portadora no modificada. Este fenómeno se denominó como supresión específica de epítopo y se ha estudiado ahora en una variedad portadora de hapteno.

El acoplamiento de polisacáridos bacterianos con proteínas portadoras ha demostrado mejorar la inmunogenicidad del polisacárido y da como resultado antígenos con características novedosas. Además,...

1. Una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T.

2. La proteína portadora de la reivindicación 1, que contiene 10, 11 ó 19 epítopos CD4+ de linfocitos T degenerados.

3. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los epítopos CD4+ derivan de una bacteria o virus patógenos.

4. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los epítopos CD4+ se derivan de la toxina del tétanos, la proteína del circunsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno superficial de la hepatitis B, la proteína central nuclear de la hepatitis B, la proteína de la matriz de la gripe, la hemaglutinina de la gripe, el toxoide de la difteria, el mutante CRM 197 de la toxina de la difteria, el complejo de proteínas de la membrana externa del grupo B de Neisseria meningitidis, la toxina pertussis o la proteína 70 del choque térmico.

5. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que los epítopos CD4+ se seleccionan de los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT y hsp70 CD4+ tal como se han definido en la Tabla

1.

6. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg y MT CD4+ tal como se han definido en la Tabla 1.

7. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT y hsp70 CD4+ tal como se han definido en la Tabla 1.

8. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT y P2TT CD4+ tal como se han definido en la Tabla

1. 9. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

52 anteriores, en la que los epítopos CD4+ son epítopos CD4+ humanos 10. Una proteína portadora que comprende una o más copias de:

**(Ver fórmula)**

11. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en forma oligomérica.

12. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, conjugada con un polisacárido.

13. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polisacárido es un polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B.

14. Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polisacárido se deriva de uno cualquiera de los siguientes organismos: S. pneumoniae, N. meningitidis, S. aureus, Klebsiella,o S. typhimurium.

15. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14

en la que el polisacárido está conjugado con la proteína mediante enlace covalente.

16. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que el polisacárido está conjugado a la proteína mediante aminación reductora.

17. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en la que existen entre dos y diez unidades de proteína por cada unidad de polisacárido.

18. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como producto farmacéutico.

19. Uso de la proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 como producto farmacéutico.

20. La proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como una vacuna o como un componente de una vacuna.

21. Uso de una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 como una vacuna o componente de vacuna.

22. Una vacuna que comprende una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

23. Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para uso en la vacunación de un mamífero.

24. La proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como inmunógeno protector en el control de enfermedades producidas por bacterias encapsuladas.

25. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

26. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25 que comprende ADN.

27. Un vector de clonación o de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25-26.

28. Una célula hospedadora transformada o transfectada con el vector de la reivindicación 27.

29. Un animal transgénico no humano que ha sido transformado mediante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26 o mediante un vector de acuerdo con la reivindicación 27.

30. Un procedimiento para preparar una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende expresar un vector de acuerdo con la reivindicación 27 en una célula hospedadora y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones en las que dicha proteína se expresa, y recuperar dicha proteína expresada de esta manera.

31. Un procedimiento de producción de una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende las etapas de:

a) construir moléculas de oligonucleótidos que codifican epítopos de péptidos;

b) hibridar las moléculas de oligonucleótidos para formar dupletes;

c) introducir los dupletes de oligonucleótidos en un vector de expresión de tal manera que codifique una proteína de fusión;

d) introducir el vector de expresión en una célula hospedadora para permitir la expresión de la proteína de fusión; y

e) aislar la proteína de fusión producida a partir de un cultivo de dichas células hospedadoras.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, que comprende además la etapa de conjugar la proteína de fusión con un polisacárido.

33. El procedimiento de la reivindicación 30, la reivindicación 31 o la reivindicación 32, en el que la célula hospedadora es una bacteria E. coli.