UTILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA GILZ PARA MODULAR LA RESPUESTA INMUNOESPECÍFICA DE UN ANTÍGENO.

Utilización de al menos: a) una proteína GILZ o un vector recombinante de expresión de la dicha proteína,

aislados o expresados en células dendríticas modificadas, y b) un antígeno seleccionado del grupo constituido por: un autoantígeno, un alergeno, un antígeno implicado en una enfermedad inflamatoria crónica, un antígeno de trasplante, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias crónicas, alergias, rechazos de injertos y de la enfermedad de rechazo de órganos en el huésped

La presente invención se relaciona con la utilización de la proteína GILZ o de agentes que modulan los efectos de dicha proteína GILZ expresada en las células dendríticas con el fin, respectivamente, de inducir linfocitos T reguladores/supresores para generar una tolerancia inmunitaria, particularmente en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias, alergias, rechazo de injertos y enfermedad de rechazo de órganos en el huésped, o al contario de inhibir los linfocitos T reguladores/supresores presentes para romper un estado de tolerancia, particularmente en el tratamiento del cáncer o de infecciones crónicas o para inducir una respuesta inmune eficaz contra un antígeno de vacuna.

Las células dendríticas (CD) se describen clásicamente como las mejores células que presentan antígenos a los linfocitos T. En efecto, las células dendríticas son capaces de presentar antígenos péptidicos a través de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y de clase II (CMH I y CMH II) respectivamente a los linfocitos T CD8+ y CD4+ y de inducir después de la activación una respuesta inmune efectiva. Los datos más recientes indican que bajo el efecto de diferentes factores fisiológicos y/o de agentes farmacológicos, las células dendríticas son, por el contrario, capaces de inhibir la activación de los linfocitos T y así inducir un estado de tolerancia. La tolerancia inmune resulta de dos procesos: la inducción de energía o de la apoptosis de las células de respuesta y la generación de linfocitos T que poseen funciones supresoras (T reguladores/supresores).

Los linfocitos T reguladores/supresores juegan un papel principal, tanto fisiológicamente como en situaciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo de órganos, infecciones crónicas y proliferaciones malignas (Hisaeda et al., Nat. Med. 2004, 10, 29-; Lundgren et al., Infect. Immun., 2003, 71, 1755-; Hasenkrug, Novartis Found. Symp., 2003, 252, 194-; Boyer et al., Blood, 2004, 103, 3428 – 3430; Woo et al., Cancer Res., 2001, 61, 4766-; Sasada et al., Cancer, 2003, 98, 1089-; Wolf et al., Clin. Cancer Res., 2003, 9, 606-; Ichihara et al., Clin. Cancer Res., 2003, 9, 4404; Salomon et al., Immunity, 2000, 12, 431; Takahashi, Curr, Top. Med. Chem., 2003, 3, 693-; Xu et al., J. Immunol; 2003, 170, 394-).

Hasta ahora se han descrito tres poblaciones de linfocitos T reguladores/supresores: i) las células Th3 que son CD4+CD25-, producen el Transforming Growth Factor beta (TGFβ), de la interleucina (IL)-10 e IL-4 que tiene una acción supresora por un mecanismo que depende del TGFβ (Weiner et al., Immunol. Rev., 2001, 182, 207-); ii) las células T reguladoras de tipo 1 (Tr1) que representan igualmente una baja población CD4+, producen el IL-10 y el TGFβ pero utilizan el IL-10 para su diferenciación y su función supresora (Groux, Transplantation, 2003, 75, 85-; Levings et al., J. Exp. Med., 2002, 196, 133) iii) las células CD4+CD25high (Treg) cuya acción supresora, se inicia después de una activación específica del antígeno a través del receptor de células T (TCR), se ejerce de manera independiente del antígeno inhibiendo la producción de IL-2, y favoreciendo la detención del ciclo celular de las células CD4+ y CD8+ por un mecanismo que implica el contacto celular y parcialmente el TGFβ pero no el IL-10 (Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 2001, 182, 18-; Shevach, Nat. Rev. Immunol. 2002, 2, 389-).

Aunque el fenotipo, el perfil de expresión citoquímico y los mecanismos supresores de los linfocitos Th3, Tr1 y Treg hayan sido caracterizados, la interacción de los linfocitos reguladores/supresores con la células dendríticas y el papel de esta interacción en la inducción/inhibición de los linfocitos reguladores/supresores no es bien conocida. Se ha demostrado que el tratamiento de las células dendríticas por corticoides o el ILinducen los linfocitos T para que posean funciones supresoras (Hackstein et al., précité; Steinman et al., Ann. Rev. Immunol. 2003, 21, 685 – 711; Ashworth et al., Eur. J. Immunol. 2000, 30, 1233 – 1242; Muller et al., J. Invest. Dermatol., 2002, 119, 836 – 841; Steinbrink et al., Blood., 2002, 99, 2468 – 2476; Akbari et al., Nat. Immunol. 2001, 2, 725 – 731). Sin embargo, no se han identificado los genes capaces de inducir o, al contrario, de inhibir los linfocitos T reguladores específicos del antígeno, que representan objetivos terapéuticos para modular los linfocitos T reguladores/supresores.

La mejora del conocimiento humano que se relaciona con la inducción y la inhibición de los linfocitos T reguladores/supresores permitirá considerar su utilización terapéutica, bien sea para favorecer o inducir un estado de tolerancia con miras al tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o alergias o control de la enfermedad de rechazo de órganos en el huésped o de rechazo de injertos en el marco de trasplantes alogénicos, bien sea al contrario para inducir una mejor respuesta inmune contra un antígeno tumoral, un antígeno responsable de infección crónica o un antígeno para vacunas, inhibiéndolos.

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El gen que codifica para la proteína GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucina Zipper) se ha clonado a partir de linfocitos T y de linfocitos murínicos cultivados en presencia de glucocorticoides. La proteína GILZ murina y su homólogo humano corresponden respectivamente a las secuencias SWISSPROT Q9Z2S7 y Q99576 y los ADNc que codifican las dichas proteínas en las secuencias GenBank AF024519 y AF228339. En estas células, la GILZ inhibe la muerte celular (apoptosis) inducida por la activación del receptor T para el antígeno (D'Adamio et al., Immunity, 1997, 7, 803). La GILZ se induce igualmente por los glucocorticoides en los linfocitos B y los macrófagos humanos (Berrebi et al., BLOOD, 2003, 101, 729 – 738). En los linfocitos B, la GILZ inhibe la activación por el receptor B para el antígeno (Glynne et al., Immunol. Rev., 2000, 176 -216-). En los macrófagos, la GILZ actúa al menos en parte bloqueando la activación monocitaria inducida por extractos bacterianos (LPS) o activadores de origen linfocitario T (CD40L, IFN-gamma) e inhibe la producción de quimioquinas proinflamatorias y moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 (Berrebi et al., precitados). Además, se observa una desregulación de la expresión de GILZ en los macrófagos en los procesos inflamatorios ligados a las reacciones de hipersensibilidad retardada (represión de GILZ durante la enfermedad de Crohn, o de la tuberculosis) y en los tumores (persistencia de la expresión de GILZ en el transcurso de los linfomas de Burkitt). La expresión de GILZ puede ser inducida igualmente en otros tipos de células, por parte de diferentes estimulantes: aldosterona y vasopresina en células tubulares renales murinas (Robert-Nicoud et al., P.N.A.S., 2001, 98, 2712-), o células mesenquimatosas (Shi et al., EMBO Rep., 2003, 4, 374-).

La regulación de la producción de GILZ incluye sitios de fijación del receptor de glucocorticoides sobre su promotor, y la presencia de cofactores de la familia de Sonic Hedgehog (Ingram et al., Oncogene, 2002, 21, 8196-) o de la familia Forkhead (Asselin-Labat et al., Blood, 2004, 104, 215 – 223). Los efectos de GILZ parecen ejercerse sobre varias vías de activación celular: la vía NF-kB (Riccardi et al., Adv. Exp. Med. Biol., 2001, 495, 31-), la vía AP-1 (Mittelstadt et Ashwell, J. Biol. Chem., 2001, 276, 29603-), la vía de las MAP quinasas (Ayroldi et al., Mol. Cell. Biol., 2002, 22, 7929-).

Se ha demostrado particularmente que la proteína GILZ era un inhibidor de la vía de las MAP quinasas capaz de bloquear la transducción de señales mediadas por Raf/Ras, útiles para inhibir la proliferación celular asociada al cáncer, a enfermedades autoinmunes, a patologías inflamatorias y al rechazo de injertos (Solicitud Internacional PCT WO 03/054193.

Los inventores han puesto en evidencia nuevas propiedades de la proteína GILZ, ligadas a su expresión en células diferentes a las células precitadas, permitiendo considerar nuevas utilizaciones de la proteína GILZ.

Los inventores han demostrado que la expresión de GILZ se alcanza en el transcurso de la diferenciación de los precursores de células dendríticas (CD34+ o monocitos) en células dendríticas inmaduras (iMDDC) y que la activación de las células dendríticas por el CD40L, que permite su maduración no restaura esta producción. Sin embargo, la inducción de la expresión de GILZ en las células dendríticas inmaduras (iMDDC) o maduras (MDDC) privilegia las funciones de... [Seguir leyendo]

1. Utilización de al menos: a) una proteína GILZ o un vector recombinante de expresión de la dicha proteína, aislados o expresados en células dendríticas modificadas, y b) un antígeno seleccionado del grupo constituido por: un autoantígeno, un alergeno, un antígeno implicado en una enfermedad inflamatoria crónica, un antígeno de trasplante, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias crónicas, alergias, rechazos de injertos y de la enfermedad de rechazo de órganos en el huésped.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada por que la dicha proteína GILZ es la proteína humana.

3. Utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada por que el dicho antígeno definido en b) se selecciona del grupo constituido por: Phleum pratense, Dermatophagoides pteronyssimus y farinae, un antígeno del látex tal como Hev b 1 a 11, proinsulina, MAG, tiroperoxidasa y tireoglobulina.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la dicha proteína GILZ o el vector recombinante de expresión de la dicha proteína, aislados, se asocian con una molécula que permite el direccionamiento y/o el paso de la membrana plásmica de la células dendríticas, seleccionadas del grupo constituido por péptidos de la membrana, lípidos, ligandos de un receptor de la membrana o de un antígeno de superficie de células dendríticas y de anticuerpos dirigidos contra: DC – SIGN, CD40, DEC-205, langerina, el receptor para la manosa o receptores de depuración.

5. Utilización según la reivindicación 4 caracterizada por que el dicho receptor de membrana o antígeno de superficie de las células dendríticas, se selecciona del grupo constituido por: DC-SIGN, CD40, DEC-205, langerina, el receptor para la manosa y un receptor de depuración.

6. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el dicho vector comprende un casete de expresión que incluye un promotor de un gen expresado de manera específica o preferiblemente en células dendríticas.

7. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada por que el dicho promotor es el de un gen que codifica para una proteína seleccionada del grupo constituido por: DC-SIGN, CD11c, una molécula del complejo principal de histocompatibilidad de la langerina.

8. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que el dicho vector de expresión definido en a) es un lentivirus.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que la dicha proteína GILZ está bajo la forma de una proteína quimérica que incluye la secuencia del dicho péptido que permite el direccionamiento y/o el paso de la membrana plásmica de las células dendríticas y/o la secuencia del dicho antígeno definido en b).

10. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que el dicho antígeno se carga en las dichas células dendríticas modificadas o es presentado por las dichas células.

11. Medicamento que comprende al menos células dendríticas modificadas por una molécula seleccionada del grupo constituido por: una proteína GILZ y un vector recombinante de expresión de la dicha proteína tales como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 10.

12. Medicamento según la reivindicación 11, caracterizado por que comprende igualmente un antígeno tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 9 y 10.

13. Utilización de células dendríticas modificadas tales como se define en la reivindicación 11 o 12, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de enfermedades tales como se define en la reivindicación 1.

**(Ver fórmula)**

5 14. Medicamento que comprende al menos: a) una proteína GILZ o un vector recombinante de expresión de la dicha proteína, y b) un antígeno de interés y/o una molécula que permite el direccionamiento y/o el paso de la membrana plásmica de las células dendríticas tales como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Medicamento según la reivindicación 14, caracterizado por que comprende uno o varios vectores recombinantes de expresión que codifican para la dicha proteína GILZ, permitiendo el dicho antígeno y/o la dicha molécula el direccionamiento y/o el paso de la membrana plásmica de las células dendríticas, seleccionados del grupo constituido por péptidos de la membrana, lípidos, ligandos de un receptor de la membrana o de un antígeno de superficie de las células dendríticas y de los anticuerpos dirigidos contra : DC – SIGN, CD40, DEC-205, langerina, el receptor para la manosa y receptores de depuración.

16. Procedimiento de inducción de linfocitos T supresores/reguladores in vitro, a partir de una muestra de tejido que contiene células T CD4+ y/o CD8+, caracterizado por que comprende al menos:

a1) la preparación de células dendríticas autólogas que expresan la proteína GILZ), y, de manera simultánea o secuencial, b1) la incubación de las dichas células dendríticas obtenidas en a1) con un antígeno tal como se define en la reivindicación 1, 3, 9 o 10, y la dicha muestra de tejido que contiene las dichas células T CD4+ o CD8+.