Un procedimiento de purificar partículas de adenovirus a partir de una preparación de cultivos celulares que comprende:

a) lisar células dentro de la preparación de cultivo celular; b) aclarar el lisado que contiene las partículas adenovirales; c) tratar el lisado aclarado con nucleasa; y d) someter el lisado aclarado y tratado con nucleasa a cromatografía de intercambio aniónico; en el que los tampones usados en la cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no iónico

Procedimientos de purificación de adenovirus.

Referencia cruzada a solicitudes de patente relacionadas

Esta solicitud reivindica beneficio, de conformidad con 35 U.S.C. NAK119(e), a la solicitud provisional de los Estados Unidos 60/380,322, presentada el 14 de mayo de 2.002.

Estado con respecto al Patrocinio Federal R&D

No Aplicable.

Referencia al apéndice de microficha

No Aplicable.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de purificar partículas virales, especialmente partículas de vectores de adenovirus recombinantes. Este procedimiento se desarrolla para purificar adenovirus a partir de lisado celular. Ello usa una combinación de precipitación selectiva, filtración en profundidad y/o centrifugación, ultrafiltración, digestión con nucleasas y cromatografía para producir producto altamente purificado de forma sólida y económica.

Es este procedimiento, los niveles de DNA huésped contaminante se reducen consistentemente a menos del límite de cuantificación de un ensayo basado en PCR específico para DNA humano (< 5 pg/10¹¹ pv).

Antecedentes de la invención

Los avances en las áreas del uso de los vectores virales recombinantes para aplicaciones de terapia génica y vacunación de DNA han creado una necesidad para elaboración y purificación a gran escala de virus de calidad clínica. Una familia tal de virus son los adenovirus. Los adenovirus se agrupan dentro de la familia Adenoviridae, que se dividen entre el género Aviadenovirus (de aves) y Mastadenovirus (de seres humanos, de simios, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, caninos y de zarigüeyas). Una revisión de la familia Adenoviridae se puede encontrar en Fundamental Biology, 3ª ed., Fields, B.N., Knipe, D.M. y Howley, P.M., Ed., en el capítulo 30, páginas 979-1016 (1996), que se incorpora por la presente mediante referencia. De interés específico en las aplicaciones de vacunación génica y/o de terapia génica es el uso de un adenovirus incompetente en replicación de primera generación (FG), hecho defectivo por las deleciones de genes E1 y/o E1/E3, en base al serotipo de adenovirus. Los adenovirus tienen un tropismo celular amplio que incluye células que presentan antígenos especializadas tales como macrófagos y células dendríticas, pueden infectar (si no se replican en ellas) células de la mayoría de las especies animales, y pueden producirse en grandes cantidades en líneas celulares humanas apropiadas designadas para proporcionar el producto del gen E1 in trans.

El genoma de adenovirus está generalmente asociado a patologías benignas en seres humanos y la organización genómica del virus se ha estudiado bien desde su descubrimiento en los primeros años 50. Además, el genoma es susceptible de manipulación, dependiendo de la estrategia usada para construir el vector respectivo. Un virus de replicación incompetente (tal como un vector Ad5gag en el que se han eliminado E1/E3 que expresa un transgén gag del VIH, como se ejemplifica en el presente documento) requiere una línea celular que complementa las deleciones. Cualquier línea celular tal se puede usar para generar vectores virales recombinantes, con líneas celulares preferidas, pero no limitantes, que incluyen células 293 y células PER.C6^TM. Para este fin, se han descrito numerosos vectores de adenovirus recombinantes de 1ª generación en la bibliografía (por ejemplo, véase Bett, y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8802-8806; documentos WO 01/02607 y WO 02/22080). Los vectores adenovirales "Cobardes" son un vector adenoviral de 2ª generación generalmente desprovisto de secuencias codificantes de proteínas víricas, frecuentemente con proteínas virales suplementadas in trans por un virus coadyuvante (a menudo un adenovirus del que se ha eliminado E1) cultivado con el adenovector dependiente de adyuvante (HD) en una línea celular que lo envuelve (por ejemplo, PER.C6^TM). Ausentes las proteínas virales, estos vectores virales pueden, con carácter alternativo, suplementarse in trans por una línea celular y/o "virus coadyuvante" capaz de expresar las proteínas adenovirales estructurales y funcionales necesarias para replicación, envoltura y rescate exitoso. En vista de la mayor popularidad de estos vectores virales y de la necesidad última para preparar cantidades a escala comercial bien de una vacuna basada en virus o bien de un vehículo de terapia génica, ha llegado a ser esencial para crear procedimientos económicos y escalables de producción y purificación.

Los primeros informes de purificación cromatográfica de adenovirus a pequeña escala se comunicaron en los últimos años 50 y en los primeros años 60 (por ejemplo, véase Klemperer y Pereira 1959, Virology 9: 536-545; Philipson, 1960, Virology 10: 459-465; Haruna, y col, 1961, Virology: 13 264-267), pero se reemplazaron por centrifugación en un gradiente de CsCl. En la última década la purificación cromatográfica de los adenovirus se ha comunicado de nuevo.

La Patente de los Estados Unidos N.º 5,837,520 (véase también Huyghe y col., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) revela un procedimiento de purificar adenovirus que comprende tratar el lisado celular con una nucleasa, seguida por (1) intercambio aniónico y (2) cromatografía de iones metálicos.

La Patente de los Estados Unidos 6,261,823 revela un procedimiento de purificar adenovirus que comprende someter una preparación vírica a cromatografía de intercambio aniónico seguida por cromatografía de exclusión por tamaño.

La Patente de los Estados Unidos 6,194,191 describe procedimientos de purificar adenovirus usando velocidades de perfusión baja durante el cultivo celular, una etapa de lisis por detergente, y/o una etapa de cromatografía individual.

Shabram y col., 1997 (Human Gene Therapy 8: 453-465) revela un procedimiento para medir la concentración de Ad5 con cromatografía de intercambio aniónico analítica.

A pesar de estas comunicaciones y otras, persiste la necesidad de desarrollar un procedimiento a gran escala para purificación de vectores virales generados dentro de sistemas de cultivo de células huésped que trate tanto los asuntos cuantitativos como los cualitativos que se imponen en una vacuna o producto de terapia génica comercializado.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de purificar partículas virales. Pare este fin, la presente invención se refiere a un procedimiento de purificar partículas de adenovirus a partir de una preparación de cultivo celular que comprende: a) lisar células dentro de la preparación de cultivo celular; b) aclarar lisado que contiene las partículas adenovirales; c) tratar el lisado aclarado con nucleasas; y d) someter el lisado tratado con nucleasas, aclarado a cromatografía de intercambio aniónico; en el que los tampones usados en la cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no iónico. Un virus preferido para purificación por los procedimientos revelados en el presente documento es cualquier serotipo de adenovirus. El serotipo de adenovirus a purificar es bien una forma de tipo silvestre, una forma modificada o una forma recombinante del serotipo de adenovirus respectivo. La presente invención se ejemplifica, pero no significa que se limite a ello, por un procedimiento para purificar 5 partículas de vector de adenovirus recombinante, 6 partículas de vector de adenovirus y 35 partículas de vector de adenovirus. Otras partículas de vector de adenovirus para purificación por los procedimientos revelados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, 26 partículas de adenovirus y 36 partículas de adenovirus.

El procedimiento de la presente invención puede incluir las siguientes etapas de procedimiento: (1) liberar partículas de virus a partir de células infectadas por una etapa de lisis tal como una etapa de lisis por detergente; (2) precipitación selectiva para eliminar un alto porcentaje de ácidos nucleicos contaminantes; (3) filtración en profundidad y/o centrifugación para eliminar restos celulares y precipitado de ácidos nucleicos; (4) ultrafiltración para reducir volumen e intercambio de tampón; (5) tratamiento de nucleasa para digerir los ácidos nucleicos que quedan y para facilitar eliminación; (6) cromatografía de intercambio aniónico para purificar virus de contaminantes celulares, componentes de virus no ensamblados y cápsides vacías; (7) ultrafiltración... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de purificar partículas de adenovirus a partir de una preparación de cultivos celulares que comprende: