Un péptido asociado a un tumor conforme a la secuencia SEQ ID n.

º 2 (VMAGDIYSV) o un péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 2 en el que las cadenas laterales de uno o dos residuos de aminoácidos están alteradas y tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad humana (MHC) de clase I HLA-A*02

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal. La presente invención se refiere, además, a epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que actúan como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente invención se refiere a dos novedosas secuencias peptídicas derivadas de moléculas HLA de clase I y II de líneas celulares tumorales humanas, que puede ser usada en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales.

Antecedentes de la invención

La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune.

Determinados elementos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos de poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre periférica sugiere que estos linfocitos tienen un papel importante en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col, «Annals N.Y. Acad. Sci.» 1993 690: 101-112). En particular, los linfocitos T CD8+ (TCD8+), que reconocen péptidos que alojan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de, normalmente, 8 a 10 residuos derivados de proteínas ubicadas en el citosol, tienen un papel importante en esta respuesta. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células con un núcleo con péptidos resultantes de la división proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células profesionales presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y, posteriormente, son procesadas. Los complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8+. Los complejos de péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4+.

Los linfocitos T colaboradores CD4+ tienen un papel importante en la organización de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta razón, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4+ derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) puede ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunes antitumorales (Kobayashi H, R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta y E. Celis; 2002; Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen; «Clin. Cancer Res»; 8: 3219-3225. Gnjatic, S, D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth y L. J. Old; 2003;

Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses; «Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A»; 100(15):8862-7).

En muestras de mamíferos como, por ejemplo, ratones, se mostró que, incluso en ausencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores (es decir, de linfocitos T CD8+), los linfocitos T CD4+ son suficientes para inhibir la manifestación de tumores por medio de la inhibición de la angiogénesis por secreción de interferón-γ (IFNγ) (Qin, Z. y T. Blankenstein; 2000; CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells; «Immunity»; 12: 677-686). Adicionalmente, se mostró que los linfocitos T CD4+ que reconocen péptidos de antígenos asociados a tumores presentados por moléculas HLA de clase II pueden contrarrestar la progresión del tumor por medio de la inducción de un anticuerpo (Ac) (Kennedy, R. C, M. H. Shearer, A.

M. Watts y R. K. Bright; 2003; CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. «Cancer Res.» 63:1040-1045). A diferencia de los péptidos asociados a tumores unidos a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se han descrito un pequeño número de ligandos de TAA de clase II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Debido a que la expresión constitutiva de moléculas HLA de clase II normalmente está limitada a células del sistema inmune (Mach, B, V. Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996; Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease; «Annu. Rev. Immunol.» 14:301-331), no se consideró posible el aislamiento de péptidos de clase II directamente de tumores primarios. Por lo tanto, se han descrito numerosas estrategias para dirigir antígenos a la vía de procesamiento de clase II de células presentadoras de antígenos (APC). Por ejemplo, la incubación de APC con el antígeno en cuestión para permitir que sea absorbido, procesado y presentado (Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P. van der Bruggen; 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes;

«J. Exp. Med.»; 189: 767-778); o la transfección de células con genes o minigenes codificantes del antígeno en cuestión y fusionados con la cadena invariante, que media en la translocación de antígenos al compartimento lisosomal de procesamiento y unión del MHC de clase II (MIIC).

**(Ver fórmula)**

Para que un péptido provoque una respuesta inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados en su secuencia que interaccionan con el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.

En ausencia de inflamación, la expresión de moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a células del sistema inmune, especialmente a células profesionales presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos,, macrófagos o células dendríticas.

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T específicos de tumores, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteínas, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los antígenos asociados a tumores también pueden estar presentes sólo en células tumorales como, por ejemplo, como producto de genes mutados. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso) que son expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano del testículo.

Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos «antígenos específicos de tumor», son específicos de tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos (translocaciones) como el bcr/abl, en el linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y, algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de tumores (los genes supresores de tumores para el cáncer renal, por ejemplo, son analizados en Linehan, W. M, M. M. Walther, B. Zbar; The genetic basis of cancer of the kidney; «J Urol»; dic. 2003;170 (6 Pt 1): 2163-72), que son los que realmente causan el evento de transformación, tienen lugar en casi todos los tipos de tumor. Por ejemplo, las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un péptido asociado a un tumor conforme a la secuencia SEQ ID n.º 2 (VMAGDIYSV) o un péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 2 en el que las cadenas laterales de uno o dos residuos de aminoácidos están alteradas y tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad humana (MHC) de clase I HLA-A*02.

2. El péptido asociado a un tumor conforme a la reivindicación n.º 1, en el que hay enlaces no peptídicos.

3. Una proteína de fusión que comprende el péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 o 2 y que, en particular, comprende aminoácidos de extremo N de la cadena invariante (Ii) asociada al antígeno HLA-DR.

4. Un ácido nucleico que consta de una secuencia que codifica un péptido conforme a la reivindicación n.º 1.

5. El ácido nucleico conforme a la reivindicación n.º 4, el cual es DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, o combinaciones de los mismos.

6. Un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5.

7. Un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5 o un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 6 para su uso en medicina.

8. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5 o un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 6.

9. La célula huésped conforme a la reivindicación n.º 8 que es una RCC recombinante o una célula Awells.

10. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5 o un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 7, y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

11. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación n.º 10 que, además, comprende un péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 1 o un péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 1, en el que las cadenas laterales de uno o dos residuos de aminoácidos están alteradas y tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad humana (MHC) de clase II.

12. La composición farmacéutica conforme a las reivindicaciones n.º 10 u 11 que, además, comprende al menos un péptido adicional que comprende una secuencia conforme a cualquiera de las secuencias SEQ ID n.º 3 a SEQ ID n.º 11.

13. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 10 a 14 en la que al menos un péptido tiene enlaces no peptídicos.

14. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que comprende péptidos que constan de secuencias de aminoácidos conformes a las secuencias SEQ ID n.º 1, SEQ ID n.º 2 y SEQ ID n.º 3 a SEQ ID n.º 11.

15. La composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 10 a 14 que, además, comprende al menos un adyuvante apropiado.

16. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación n.º 15 en la que el mencionado adyuvante se selecciona del grupo de factores estimulantes de colonias como, por ejemplo, el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF).

17. El uso de una composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 10 a 16 para la preparación de una vacuna contra el cáncer.

18. Un método para producir un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3, método que comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la reivindicación n.º 8 y la separación del péptido de dicha célula huésped o de su medio de cultivo.

19. El uso de un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3, de un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5 o de un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 6 para la fabricación de un medicamento para matar células diana en un paciente cuyas células diana expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la dada en la reivindicación n.º 1.

20. Un método in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas MHC de clase I cargadas de antígenos, expresadas en la superficie de una célula

presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar las mencionadas CTL de una manera específica de antígeno, donde el mencionado antígeno es un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3.

21. El método conforme a la reivindicación n.º 20 en el que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase I

**(Ver fórmula)**

5 expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada mediante el contacto de una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígenos.

22. El método conforme a la reivindicación n.º 20 en el que la célula presentadora de antígenos comprende un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 6.

23. Linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos según el método conforme a cualquiera de las

10 reivindicaciones n.º 20 a 22, que reconocen de forma selectiva una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en la reivindicación n.º 1.

24. El uso de un péptido asociado a un tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 1 a 3, de un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones n.º 4 o 5, de un vector de expresión conforme a la reivindicación n.º 6 y de una composición farmacéutica conforme a cualquiera de las reivindicaciones n.º 10 a 16 en la fabricación de un

15 medicamento para matar en un paciente células de cáncer.

25. El uso conforme a la reivindicación n.º 24 en el que las mencionadas células de cáncer son células de cáncer renal.