IDENTIFICADOR DE UN EPÍTOPO DE LINFOCITOS T PRESENTADO POR EL ANTÍGENO HLA-A2 Y DERIVADO DE LA PROTEÍNA DEL RECEPTOR DE LAMININA INMADURA DEL ANTÍGENO ONCOFETAL Y USOS DE ESTE.

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer y, en particular, a diversas entidades tumorales entre las que se incluyen los tumores malignos hematológicos. La presente invención se refiere, además, a un epítopo peptídico de linfocitos T colaboradores asociado a tumores, solo o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúa como ingrediente activo de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente invención se refiere a una novedosa secuencia peptídica derivada de moléculas HLA de clase I del receptor de laminina inmadura del antígeno oncofetal (OFA/iLR), que puede ser utilizado en la composición de vacunas o de otros compuestos farmacéuticos para provocar respuestas inmunológicas antitumorales. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune. Elementos específicos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir específicamente células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) de poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre periférica sugiere que estos linfocitos desempeñan un papel importante en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col, «Annals N.Y. Acad. Sci.» 1993 690:101-112; Rosenberg SA. Shedding light on immunotherapy for cancer. «N Engl J Med.» 2004 Apr 1;350(14):1461-3.). En particular, los linfocitos T CD8 + (TCD8 + ), que reconocen péptidos que alojan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I de, normalmente, 8 a 10 residuos derivados de proteínas ubicadas en el núcleo o en el citosol o de proteínas ribosómicas defectuosas (DRIP), tienen un papel importante en esta respuesta. Las DRIP son una fuente esencial para los péptidos y constituyen productos de traducción incompleta en los ribosomas. Fueron descritas por primera vez por el grupo de trabajo de J. Yewdell (Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. «Nature». 2000 Apr 13;404(6779):770-4). Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA). Existen dos clases principales de moléculas MHC, que pueden ser reconocidas por linfocitos T que alojen receptores de linfocitos T: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células con un núcleo que presenta péptidos resultantes de la división proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos. Las moléculas MHC de clase II se pueden encontrar en las células presentadoras de antígenos (APC) profesionales como macrófagos, células dendríticas, en linfocitos B, en células endoteliales y en células alteradas de tumores y de estroma tumoral que, en circunstancias normales, no expresan moléculas MHC de clase II en sus superficies y presentan proteínas exógenas que son absorbidas por las APC durante la endocitosis o que entran en el compartimiento de las moléculas MHC de clase II (MIIC) y, posteriormente, son procesadas y cargadas en los complejos MHC de clase II. Los complejos de péptidos y el MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8 + positivos. Los complejos de péptidos y el MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4 + (descritos de forma general en «Immunobiology» por Charles A., Jr. Janeway, Paul Travers, Mark Walport, Mark J. Shlomchik). Para que un péptido provoque una respuesta inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los péptidos que aglutinan MHC de clase I suelen tener de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados (anchor) en su secuencia, que interaccionan con el surco de fijación correspondiente de la molécula MHC (véase el segundo listado publicado en «Immunogenetics» [Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. «Immunogenetics». 1999 Nov; 50(3-4): 213-9]). Existen numerosos ejemplos de TCD8 + , tanto humanos como de ratones, que reconocen específicamente células tumorales y desarrollan una actividad terapéutica tras el traslado adoptivo, induciendo, en algunos casos, la remisión completa. Sin embargo, a pesar del potencial de los linfocitos T para erradicar tumores, es obvio, teniendo en cuenta el crecimiento progresivo de la mayoría de los cánceres, que muchos tumores no son reconocidos por TCD8 + in vivo. A pesar de que se ha encontrado una variedad de tumores inmunógenos, ha sido difícil demostrar la estimulación de una respuesta inmune antitumoral efectiva: investigaciones recientes muestran que las inmunizaciones pueden llevar a fuertes respuestas de los linfocitos T contra péptidos asociados a tumores (Speiser DE, Lienard D, Rufer N, Rubio- Godoy V, Rimoldi D, Lejeune F, Krieg AM, Cerottini JC, Romero P. Rapid and strong human CD8+ T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. «J Clin Invest». 2005 Mar;115(3):739-46. Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic Tlymphocytes. «Clin Cancer Res.» 2004 Jun 1;10(11):3658-66.). Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, es decir, por sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína, como enzimas, receptores, factores de transcripción, 2 ES 2 367 643 T3 etc. En la página www.syfpeithi.org se incluye una lista completa de péptidos unidos a o eluidos de moléculas MHC de clase I o clase II. Además, los antígenos asociados a tumores, por ejemplo, también pueden estar presentes solamente en células tumorales, como productos de genes mutados, por ejemplo. Buenos ejemplos de ello son los ligandos MHC de clase I, que actúan como epítopos de linfocitos T de K-ras, BCR-abl y p53 mutado. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras de tejidos específicos, como los antígenos CT (testículo canceroso) que se desarrollan en distintos tipos de tumor y en tejido sano del testículo. Otros péptidos asociados a tumores y unidos a moléculas MHC provienen de los genes, que se expresan en un número mayor de copias en las células cancerosas en comparación con células sanas del mismo órgano o tejido y de otros tejidos. Puede verse un ejemplo con el gen c-met en Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. «Clin Cancer Res.» 2004 Jun 1;10(11):3658-66. Otros péptidos asociados a tumores provienen de antígenos que se hallan en células tumorales retenidas y no secretadas (por ejemplo, proteínas de la familia genética de la mucina). Otras fuentes pueden ser las transcripciones aberrantes (sistema de lectura), péptidos de los sitios de unión de las fusiones proteína-proteína postraduccional. Puede verse una lista completa de los antígenos asociados a tumores que se han descrito en la literatura científica en la página www.cancerimmunity.org. Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se está empleando mucho esfuerzo investigador para identificar más antígenos asociados a tumores. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos antígenos de tumores específicos, son específicos de tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos como los bcr/abl en el linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y, algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de tumores (los genes supresores de tumores en el cáncer renal, por ejemplo, son analizados en Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. «J Urol». 2003 Dec;170(6... [Seguir leyendo]

1. Un péptido asociado a un tumor, seleccionado del grupo que consta de a) un péptido que muestra una longitud total de 10 aminoácidos, que constan de una secuencia según la ID de SEQ n.º 1 (LLAARAIVAI), o b) un péptido mimético retroinverso de éste. 2. El péptido asociado a tumor conforme a la reivindicación 1, con la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I, en particular al HLA-A*0201. 3. El péptido asociado a tumor conforme a las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el mencionado péptido es parte de una proteína de fusión con un epítopo estimulador CD4 + del toxoide del tétanos. 4. Un ácido nucleico que codifica a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones a a) y 2 a 4. 5. El ácido nucleico según la reivindicación 4, que es ADN, ADNc, APN, ACN, ARN o combinaciones de éstos. 6. Un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5. 7. Una célula huésped asociada que consta de un ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, o un vector de expresión según la reivindicación 6, donde dicha célula huésped no es una célula madre embrionaria. 8. Un método para producir un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a), 2 y 3, método que consta de un cultivo de la célula huésped según la reivindicación 7 y del aislamiento del péptido de la célula huésped o de su medio de cultivo. 9. Un compuesto farmacéutico que consta de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5 o un vector de expresión según la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 10. Uso de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 4 ó 5, o un vector de expresión conforme a la reivindicación 6 en la fabricación de un medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal y como se detalla en la reivindicación 1. 11. Un método in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase I con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a), 2 ó 3. 12. El método conforme a la reivindicación 11, donde la célula que presenta el antígeno consta de un vector de expresión según la reivindicación 6. 13. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 en las que la molécula MHC de clase I es HLA­ A*0201. 33 Figura 1 % de lisis específica Figura 2 Ensayo de liberación de ILR1 51Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 % de lisis específica anticuerpo contra: ratio E:T (efector/diana) Bloqueo de anticuerpos de lisis específica de ILR1 receptor de linfocitos T ES 2 367 643 T3 % de lisis de células diana IM9 CD4 CD8 MHC de clase I 34 K562 IM9 Karpas-422 Balm-3 U266 REH Mec-2 Mec-1 HMFG-1 MAM-6 PBS (control negativo) PBMC autóloga PBMC alogénica Figura 3 (A) % de lisis específica (B) % de lisis específica Ensayo de liberación de ILR1 51Cr ratio E:T (efector/diana) Ensayo de liberación de ILR1 51Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) ES 2 367 643 T3 LLC-01 (A*02 positivo) LLC-02 (A*02 positivo) LLC-03 (A*02 positivo) LLC-04 (A*02 positivo) LLC-05 LLC-06 LLC-07 LLC-08 células B (A*02 positivo) células B activadas (A*02 positivo) células B activadas (A*02 positivo) + péptido ILR1 LLC-01 (A*02 positivo) LLC-02 (A*02 positivo) LLC-03 (A*02 positivo) LLC-05 LLC-06 Figura 4 (A) (B) % de lisis específica % de lisis específica Ensayo de liberación de ILR1 51Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) Ensayo de liberación de ILR1 51Cr ratio E:T (efector/diana) ES 2 367 643 T3 36 LMA-01 (A*02 positivo) LMA-02 (A*02 positivo) LMA-03 (A*02 positivo) LMA-06 LMA-02 (A*02 positivo) LMA-04 (A*02 positivo) LMA-05 (A*02 positivo) LMA-09 (A*02 positivo) LMA-10 (A*02 positivo) LMA-07 LMA-01 LMA-06 LMA-12 CD34-01(A*02 positivo) CD34-02 (A*02 positivo) BM-01 (A*02 positivo) BM-02 (A*02 positivo) Figura 5A % de lisis ES 2 367 643 T3 Células diana T2 sensibilizadas de manera repetida con el péptido de ILR1 0,5 ng/ml 5 ng/ml 50 ng/ml 500 ng/ml 5000 ng/ml ng/ml Concentración de péptido 37 T2 + péptido de VIH T2 + péptido de ILR1 Figura 5B % de lisis específica del blanco primario ES 2 367 643 T3 ILR1: inhibición de dianas frías 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) 38 T2 (sin cargar) T2 + péptido de control (Survivin 96-104) T2 + ILR1 T2 + ILR2 células tumorales de LMA con A*02-positivo Figura 6 % de lisis específica Figura 7 Ensayo de liberación de ILR2 51-Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 % de lisis específica Anticuerpo contra: ratio E:T (efector/diana) Bloqueo de anticuerpos de lisis específica de ILR2 receptor de linfocitos T ES 2 367 643 T3 % de lisis de células diana IM9 CD4 CD8 MHC de clase I 39 K562 IM9 Karpas-422 Balm-3 U266 REH Mec-2 Mec-1 PBMC autóloga PBMC alogénica HMFG-1 MAM-6 PBS (control negativo) Figura 8 (A) (B) % de lisis específica % de lisis específica Ensayo de liberación de ILR2 51-Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) Ensayo de liberación de ILR2 51Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) ES 2 367 643 T3 LMA-02 LMA-04 LMA-05 LMA-10 LMA-07 LMA-01 LMA-06 LMA-12 CD34-01 CD34-02 BM-01 BM-02 LMA-01 (A*02 positivo) LMA-02 (A*02 positivo) LMA-03 (A*02 positivo) LMA-06 Figura 9 (A) % de lisis específica (B) % de lisis específica Ensayo de liberación de ILR2 51Cr ratio E:T (efector/diana) Ensayo de liberación de ILR2 51Cr 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) ES 2 367 643 T3 41 LLC-01 (A*02 positivo) LLC-02 (A*02 positivo) LLC-03 (A*02 positivo) LLC-04 (A*02 positivo)) LLC-05 LLC-06 LLC-07 LLC-08 células B (A*02 positivo) células B activadas (A*02 positivo) células B activadas (A*02 positivo) + péptido ILR2 LLC-01 (A*02 positivo) LLC-02 (A*02 positivo) LLC-03 (A*02 positivo) LLC-05 LLC-06 Figura 10A % de lisis Células diana T2 sensibilizadas de manera repetida con el péptido de ILR2 Concentración de péptido ES 2 367 643 T3 42 T2 + péptido de VIH T2 + péptido de ILR2 Figura 10B % de lisis específica de dianas primarias ILR2: inhibición de dianas frías 5:1 10:1 20:1 40:1 ratio E:T (efector/diana) ES 2 367 643 T3 43 T2 (sin cargar) T2 + péptido de control (Survivin 96-104) T2 + ILR1 T2 + ILR2 células tumorales de LMA con A*02-positivo Figura 11A Figura 11B Mean FLI 350 350 Flum1 iLR3 iLR6 iLR1 iLR4 msurv33 iLR2 iLR5 100 50 25 10 5 1 0.5 0.25 150 150 Concentración del péptido (micromol) Mean FLI = FLI medio ES 2 367 643 T3 Mean FLI 44 Flum1 iLR9 iLR12 iLR7 iLR10 iLR13 iLR8 iLR11 iLR14 100 50 25 10 5 1 0.5 0.25 Concentración del péptido (micromol)