NUEVAS PROTEÍNAS DE ADHESIÓN DE BACTERIÓFAGOS.

La presente invención se refiere a proteínas de adhesión de bacteriófagos que se unen al antígeno O de bacterias gram negativas, que carecen de la capacidad de unión a un bacteriófago y de hidrolizar lipopolisacáridos. La invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia que codifica las proteínas de acuerdo con la presente invención. La invención se refiere además al uso de dichas proteínas y a procedimientos de detección, purificación y enriquecimiento de bacterias. Los bacteriófagos son virus muy específicos que infectan únicamente bacterias. Para la infección, los bacteriófagos usan estructuras de adhesión para unirse a sus huéspedes bacterianos. La especificidad de los bacteriófagos se define sobre una línea de sus propias proteínas, que son importantes para la unión a la célula diana. Los sistemas fago-bacteria han evolucionado en la naturaleza durante largos periodos de tiempo de tal manera que los fagos reconocen su bacteria huésped de manera muy específica y con un elevado nivel de afinidad de unión. La unión específica de los bacteriófagos a las bacterias se produce mediante las proteínas de adhesión de los bacteriófagos. Las proteínas de adhesión de los bacteriófagos se unen específicamente a diversos grupos de receptores localizados sobre la superficie de las bacterias. Estos receptores superficiales bacterianos pueden ser componentes de los lipopolisacáridos, especialmente el antígeno O, o bien del núcleo del LPS en bacterias gram negativas así como del antígeno K sobre la superficie de bacterias gram negativas, que es un polisacárido capsular, componentes del peptidoglicano o ácidos teicoicos o lipoteicoicos en bacterias gram positivas, proteínas asociadas a membranas de bacterias, protuberancias bacterianas especiales como flagelos, pelos o fimbrias o componentes extracelulares como cápsulas, capas de baba, carbohidratos, matrices de polisacáridos, capas de proteínas superficiales o proteínas asociadas a la pared celular. Algunas de las proteínas de adhesión a bacteriófagos son enzimáticamente activas, por ejemplo, las proteínas de unión al antígeno O, o al antígeno K, otras no lo son, por ejemplo, las proteínas de adhesión de bacteriófagos que se unen a proteínas bacterianas asociadas a membranas. El lipopolisacárido (LPS) es una parte de la membrana externa de las bacterias gram negativas que está compuesta por el lípido A, la región del núcleo, y el antígeno O. El antígeno O es la parte superficial más expuesta del lipopolisacárido bacteriano que está compuesto por unidades repetitivas de oligosacáridos, el lípido A es la región anclada en el interior de la membrana externa de las bacterias gram negativas, en comparación con el lípido A y el núcleo, el antígeno O es la parte más variable del lipopolisacárido bacteriano. La enorme variación en las estructuras del antígeno O (algunos cientos de variantes) proporciona una base para la detección de bacterias por debajo del nivel del serogrupo. La detección bacteriana convencional usa anticuerpos para diferenciar entre cepas bacterianas estrechamente relacionadas. Por ejemplo, en la técnica actual se clasifica Salmonella mediante el uso de diferentes antisueros en 46 serogrupos con 67 diferentes antígenos O (algunos serogrupos se han definido como una combinación de más de un antígeno O). Las bases de datos de E. coli (ECODAB; Stenutz y col., 2006, FEMS Microbiol. Rev. 30, 382-403) relacionan 178 antígenos O diferentes. Los serotipos de E. coli se identifican convencionalmente en procedimientos de aglutinación clásicos usando antisueros contra E. coli. Los bacteriófagos que se producen naturalmente utilizan diferentes receptores sobre las superficies bacterianas para la adsorción en las células bacterianas. Las proteínas de adhesión de bacteriófagos están compuestas por al menos dos dominios funcionales, en las que el dominio en el extremo N se une al bacteriófago y el dominio C terminal se une a un receptor sobre la superficie bacteriana. Este dominio C terminal comprende también el sitio activo, si la proteína de adhesión al bacteriófago es enzimáticamente activa, por ejemplo, hidroliza el antígeno O o el antígeno K bacteriano. Sin embargo, como las proteínas de adhesión de bacteriófagos están a menudo compuestas por una disposición modular de dominios, se observa a menudo una homología variable de las diferentes partes funcionales. Tras la unión, el antígeno O que se une a las proteínas de adhesión de bacteriófagos que presentan una actividad hidrolítica hidroliza el antígeno O del lipopolisacárido. Dicha hidrólisis del lipopolisacárido es una parte del proceso de penetración de la capa de lipopolisacárido durante la infección del bacteriófago. Otro proceso implicado en la infección del bacteriófago es el denominado desplazamiento por la superficie. Dicho desplazamiento por la superficie se lleva a cabo mediante la infección del bacteriófago con el fin de encontrar un sitio sobre la superficie bacteriana que sea adecuado para la inyección del ADN. Ambos procesos biológicos (penetración del lipopolisacárido y desplazamiento por la superficie comprenden una unión repetitiva y la liberación del bacteriófago. Consiguientemente, la unión de dicho proteína de adhesión del bacteriófago con el antígeno O sobre la superficie bacteriana es una unión reversible producida por la actividad hidrolítica de dicha proteína de adhesión del bacteriófago El elevado nivel de afinidad de unión califica las proteínas de adhesión del bacteriófago como biosorbentes para la unión específica de bacterias incluso en entornos complejos como se produce en la naturaleza, pero también en muestras biológicas, como por ejemplo, en alimentos 2   Existen diferentes aplicaciones para el uso de proteínas de adhesión de bacteriófagos como biosorbentes, tales como, por ejemplo, la detección e identificación de cepas bacterianas individuales o grupos de bacterias o la purificación de células bacterianas y componentes celulares. La detección rápida y exacta de bacterias es la primera etapa esencial para el diagnóstico y el tratamiento de una infección bacteriana en seres humanos y animales así como para iniciar medidas preventivas. Además, la detección es útil para el control higiénico y la calidad de las materias primas y el procesado de comestibles y para vigilar la higiene y el aspecto de la calidad del agua potable y del agua para usos industriales y la calidad del agua de los baños públicos. Adicionalmente, la detección es útil para el proceso de vigilancia y optimización y para el control de calidad en las analíticas ambientales. Los documentos EP1198713A2 y EP1356080A1 describen procedimientos para la detección e identificación de cepas bacterianas individuales y grupos de bacterias, en el que bacteriófagos completos o proteínas de bacteriófagos se acoplan a un soporte. Tras una incubación de los bacteriófagos acoplados o proteínas de bacteriófagos con una muestra de ensayo, se puede detectar la bacteria de la muestra unida a los bacteriófagos o a las proteínas de los bacteriófagos. Las proteínas de adhesión de bacteriófagos ofrecen numerosas ventajas sobre otros biosorbentes, tales como por ejemplo, anticuerpos para la detección e identificación de bacterias, tales como especificidad superior y unión superior, cuando se usan en sistemas de ensayo microbiológicos, la mayor especificidad disminuye el uso de falsos positivos y falsos negativos, mientras que la mejor unión a la diana proporciona una mejor relación señal a ruido. Además, las proteínas de adhesión de bacteriófagos se pueden inmovilizar sobre cualquier superficie y se pueden acoplar fácilmente con otras moléculas tales como, por ejemplo, marcadores fluorescentes. Se han probado proteínas de adhesión de bacteriófagos para proporcionar un comportamiento robusto en muchas aplicaciones diferentes, incluso cuando se estimulan con las matrices de alimentos más complejas y exigentes. Adicionalmente, la purificación de células bacterianas y de componentes celulares es muy importante para casi cualquier procesamiento, análisis, o aislamiento adicional de componentes celulares. El documento EP1399551A2 describe un procedimiento para la purificación de células bacterianas y de componentes celulares, en el que una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares se pone en contacto con bacteriófagos completos o proteínas de bacteriófagos. Posteriormente, dicha muestra de células bacterianas o de componentes celulares y los bacteriófagos o las proteínas de bacteriófagos se incuban con un soporte sólido. Tras la incubación, se puede separar el soporte sólido de la muestra y por tanto las células bacterianas o componentes bacterianos se unen a los bacteriófagos o... [Seguir leyendo]

1.- Una proteína de adhesión de bacteriófagos que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 9, 11, o 12. 2.- Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, preferiblemente como se representa en la SEC ID Nº: 48-51. 3.- Un vector que codifica una proteína de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1. 4.- Una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de acuerdo con la reivindicación 3. 5.- Uso de una proteína de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1 para la unión, el enriquecimiento, la eliminación, la captura y la detección de bacterias gram negativas en una muestra. 6.- Un procedimiento para detectar bacterias, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: a) acoplamiento a un soporte de proteínas de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, b) incubación con una muestra del soporte acoplado a dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos, c) opcionalmente, eliminación de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos, d) opcionalmente, adición de sustancias permeabilizantes o destructoras de la membrana bacteriana, y e) detección de las bacterias en la muestra unida a dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos. 7.- Un procedimiento para detectar bacterias, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares con proteínas de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, preferiblemente con un tiempo de incubación de aproximadamente 1 s a 20 minutos, b) incubación posterior de dicha muestra, que contiene las células bacterianas o componentes celulares y dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos con un soporte sólido, preferiblemente durante aproximadamente 1-60 minutos, c) opcionalmente, eliminar la muestra y las bacterias de la muestra no unidas a dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos, d) opcionalmente, adición de sustancias permeabilizantes o destructoras de la membrana bacteriana, y e) detección de las bacterias en la muestra unida a dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos. 8.- Uso del procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación 6 o 7 para la detección de bacterias en medicina, industria alimentaria y analíticas, cría de ganado, analíticas de agua potable, o analíticas ambientales 9.- Un procedimiento para la purificación selectiva de células bacterianas o componentes celulares que comprende las siguientes etapas a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares con proteínas de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, preferiblemente con un tiempo de incubación de aproximadamente 1 s a 20 minutos, b) posterior incubación de dicha muestra, que contiene las células bacterianas o los componentes celulares y dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos con un soporte sólido, preferiblemente durante aproximadamente 1-60 minutos, y c) separación del soporte sólido con las células bacterianas o los componentes celulares unidos mediante dichas proteínas de adhesión de bacteriófagos a dicho soporte sólido de la muestra. 10.- Un procedimiento para el enriquecimiento o la purificación de las células bacterianas y/o los componentes celulares que comprende las siguientes etapas: 82   a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas y/o componentes celulares con un soporte magnético sobre la superficie del cual se han aplicado proteínas de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, preferiblemente con una incubación de aproximadamente 1-60 minutos, y b) separación del soporte magnético con las células bacterianas y/o componentes celulares unidos al mismo de la muestra. 11.- Un kit para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 9 o 10, comprendiendo el kit proteínas de adhesión de bacteriófagos de acuerdo con la reivindicación 1, un soporte y reactivos de prueba para la detección, purificación o enriquecimiento de bacterias gram negativas y/o componentes celulares. 83   84     86   87   88   89     91   92   93   94     96   97   98   99