PROCEDIMIENTO DE MARCADO O DE TRATAMIENTO DE UNA MUESTRA BIOLÓGICA QUE CONTIEN ÁCIDOS NUCLEICOS.

Procedimiento de marcado o de tratamiento de una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de purificación de una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos de interés, ácidos ribonucleicos (ARN) o ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de síntesis o naturales, que han sido marcados, tal como se define en las reivindicaciones. Por ARN o ADN de síntesis, es preciso entender ARN o ADN obtenido mediante una técnica desarrollada por el ser humano, por ejemplo una técnica de amplificación (PCR seguida eventualmente por una transcripción) o de amplificación transcripcional (TMA o NASBA). Por ARN o ADN natural, es preciso entender ARN o ADN obtenido mediante extracción de una célula, por ejemplo ARN mensajero, ribosómico, de transferencia o ADN genómico. El estado de la técnica muestra que existen numerosos métodos para marcar dichos nucleótidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos y los ácidos nucleicos se designarán todos posteriormente mediante el término polinucleótidos. El marcado puede realizarse durante la síntesis, o mediante incorporación de al menos un nucleótido marcado. Un primer método consiste en fijar el marcador a la base, ya sea ésta natural o modificada. Un segundo método propone fijar el marcador al azúcar, también en este caso ya sea natural o modificado. Un tercer método tiene por objeto la fijación del marcador al fosfato. El marcado en la base se ha utilizado particularmente en la estrategia de marcado de ácidos nucleicos mediante incorporación de nucleótidos directamente marcados. El marcado en el azúcar se utiliza a menudo en el caso de sondas nucleicas preparadas mediante síntesis química. El marcado en el fosfato también se ha utilizado para introducir brazos funcionalizados y marcadores durante la síntesis química de los oligonucleótidos. De hecho, el experto en la materia, que debe realizar un marcado de un nucleótido, o de un análogo de nucleótido o de un polinucleótido, es propenso a realizar esta fijación en la base o en el azúcar que le ofrecen más comodidad y alternativas. Esto es, por otro lado, lo que resulta del estudio de numerosos documentos, tales como EP-A­ 0.329.198, EP-A-0.302.175, EP-A-0.097.373, EP-A-0.063.879, US-A-5.449.767, US-A-5.328.824, WO-A-93/16094, DE-A-3.910.151, EP-A-0.567.841 para la base o EP-A-0.286.898 para el azúcar. La fijación del marcador al fosfato es una técnica más compleja que la técnica que consiste en funcionalizar la base o el azúcar y se ha utilizado mucho menos, particularmente a causa de la reducida reactividad del fosfato (véase por ejemplo Jencks W. P. et al J. Amer. Chem Soc, 82, 1778-1785, 1960). Del mismo modo, en la revista de O'Donnel y Mc Laughlin (Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure, p 216-243, en Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids, Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) que se refiere a los métodos de introducción de sondas en los fragmentos de oligonucleótidos, la alquilación eficaz del fosfodiéster internucleotídico está considerada como imposible. La Solicitante ha desarrollado, desde ahora, una técnica de marcado basada en nuevos reactivos que sean eficaces desde el punto de vista del rendimiento de marcado, que sean específicos a nivel de la posición de marcado y en particular que no afecten a las propiedades de hibridación de las bases implicadas en la formación de la doble hélice, por medio de puentes de hidrógeno, que sean utilizables a la vez para el ADN y el ARM, y finalmente que permiten marcar indistintamente polinucleótidos naturales o preparados mediante amplificación enzimática. De este modo, en la solicitud de patente WO-A-02/090319 se describen nuevos marcadores que responden a las condiciones mencionadas anteriormente y que utilizan la función diazometilo como función reactiva para el marcado. La función diazometilo (de fórmula -C(N2)-) ya se ha utilizado para la alquilación de los grupos fosfatos, pero se plantean cierto número de problemas. Por un lado, los derivados diazo en general son ellos mismos inestables, lo que plantea problemas para la utilización de estos reactivos de marcado en un kit de marcado, y por otro lado, el producto de acoplamiento es inestable, lo que es redhibitorio si el producto marcado tiene la función de demostrar la presencia de una molécula diana biológica en una muestra cualquiera. Finalmente, los derivados que portan la función diazometilo son insolubles en agua, lo que conduce a utilizar condiciones bifásicas para el acoplamiento con moléculas biológicas, que solamente son solubles y estables en agua o tampones acuosos, pero estas condiciones ralentizan la velocidad de reacción y, por lo tanto, perjudican a la eficacia del acoplamiento. Los nuevos reactivos de marcado de esta invención, descrita en la solicitud WO-A-02/090319, resuelven también estos problemas técnicos. De acuerdo con una realización, el reactivo de marcado estable a la temperatura es de fórmula: 2 en la que: R 1 representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido, R 2 representa un marcador detectable o al menos dos marcadores detectables unidos entre sí mediante al 5 menos una estructura multimérica, L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de al menos dos enlaces covalentes y n un número entero igual a 0 ó 1, R 3 y R 4 representan independientemente uno del otro: H, NO2, Cl, Br, F, I, R 2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR con R = alquilo o arilo, 10 A es un brazo de unión que comprende al menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el anillo aromático y u es un número entero comprendido entre 0 y 2, preferentemente de 0 ó 1, y -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-. En una nueva solicitud de patente depositada por la Solicitante con el número FR04/50600 con fecha del 26 de 15 marzo de 2004, y titulada: Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biológiques", estas moléculas basadas en la función diazo se han mejorado aún más, siguen siendo estables a la temperatura y de fórmula: en la que: 20 R 1 representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido, R 2 representa un marcador detectable o al menos dos marcadores detectables unidos entre sí por al menos una estructura multimérica, L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de al menos dos enlaces covalentes y n un número entero igual a 0 ó 1, 25 R 3 y R 4 representan independientemente uno del otro: H, NO2, Cl, Br, F, I, R 2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH- (CH2)3- (O-CH2-CH2)S-CH2-NH-R 2 , -CO-NH- (CH2)3-(O-CH2-CH2)4­ CH2-NH-R 2 con R = alquilo o arilo, A es un brazo de unión que comprende al menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el anillo aromático y u es un número entero comprendido entre 0 y 2, preferentemente 30 de 0 ó 1, -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, -Z- representa -NH-, -NHCO-, -CONH- u -O-, ES 2 367 573 T3 3 m es un número entero comprendido entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 3, y p es un número entero comprendido entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 3. Además, para que este marcado sea aún más eficaz, también es interesante que los polinucleótidos naturales o de síntesis también estén fragmentados. El tamaño reducido de estos ácidos nucleicos los hace más accesibles para el marcado. En lo que concierne a la fragmentación de los ácidos nucleicos, numerosos métodos se describen en el estado de la técnica. En primer lugar, la fragmentación puede ser enzimática, es decir que la fragmentación de los ácidos nucleicos puede realizarse mediante nucleasas (ADNasas o ARNasas). Se generan entonces fragmentos de pequeño tamaño con extremos 3'-OH, 5'-OH, 3'-fosfato, 5'-fosfato. En segundo lugar, la fragmentación puede ser química. Por ejemplo en el caso de los ADN, puede realizarse las despurinación o la despirimidinación de los ADN, que se fragmentan a continuación en presencia de una base mediante un mecanismo llamado de beta-eliminación. La fragmentación de los ADN puede realizarse mediante mecanismos de oxidación, de alquilación, de adición de radicales libres, entre otros. Para fragmentar los ARN o ADN, como se ha descrito respectivamente en la patente US-A-6.376.179 y solicitud de patente WO-A-01/44507 de los inventores, se utilizan cationes metálicos a menudo asociados a moléculas orgánicas utilizadas como catalizadores químicos, por ejemplo imidazol. Esta fragmentación se realiza preferentemente en medio alcalino y genera fragmentos con extremos 3'-fosfato. En este caso, la fijación de un marcador se realiza al nivel del fosfato aislado, de un fragmento de ácido nucleico, liberado durante el corte. No hay ninguna especificidad,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de marcado de ácidos nucleicos de interés contenidos en una muestra biológica, que consiste en: a) disponer de un recipiente de reacción, b) inmovilizar en toda o parte de la superficie interna del recipiente o de un soporte sólido introducido en este recipiente, moléculas de captura que portan funciones aniónicas y/o ácidas, que pueden fijar un marcador o precursor de marcado de los ácidos nucleicos de interés, c) introducir en dicho recipiente de reacción la muestra biológica, pero también: 1) al menos un marcador o precursor de marcado de los ácidos nucleicos de interés que comprende una función diazo, y 2) eventualmente cualquier ingrediente necesario para el marcado o pre-marcado de los ácidos nucleicos de interés, d) incubar el contenido del recipiente de reacción, e) inmovilizar el marcador o precursor de marcado que no ha reaccionado con los ácidos nucleicos de interés mediante reacción de la función diazo con las funciones aniónicas y/o ácidas de las moléculas de captura para formar un enlace covalente, y f) utilizar los ácidos nucleicos de interés marcados, es decir los que han reaccionado con dicho marcador o precursor de marcado, para etapas posteriores. 2. Procedimiento de tratamiento de una muestra biológica que contiene una mezcla de ácidos nucleicos de interés y de al menos un marcador o precursor de marcado de los ácidos nucleicos de interés que comprende una función diazo, eventualmente asociado a cualquier ingrediente necesario para el marcado de los ácidos nucleicos de interés, que consiste en: a) disponer de un recipiente de reacción, b) inmovilizar en toda o parte de la superficie interna del recipiente o de un soporte sólido introducido en este recipiente, moléculas de captura que portan funciones aniónicas y/o ácidas que pueden fijar el marcador o precursor de marcado de los ácidos nucleicos de interés, c) introducir en dicho recipiente de reacción la muestra biológica, d) incubar el contenido del recipiente de reacción, ES 2 367 573 T3 e) inmovilizar el marcador o precursor de marcado que no ha reaccionado con los ácidos nucleicos de interés mediante fijación sobre las moléculas de captura, realizándose la fijación del marcador o precursor de marcado que no ha reaccionado con los ácidos nucleicos de interés, en las moléculas de captura mediante un enlace covalente, y f) utilizar los ácidos nucleicos de interés marcados, es decir los que han reaccionado con dicho marcador o precursor de marcado, para etapas posteriores. 3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque, previamente a la etapa a), la muestra biológica es tratada de acuerdo con al menos una de las siguientes etapas: la transferencia desde otro recipiente de reacción aguas arriba, la lisis de un material biológico complejo para hacer a los ácidos nucleicos de interés accesibles y/o detectables, la captura o aislamiento de los ácidos nucleicos de interés, y/o el tratamiento de los ácidos nucleicos de interés para hacer posible su detección o mejorar su detección. 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa f) viene seguida por al menos una etapa posterior siguiente: la transferencia a otro recipiente de reacción aguas abajo, el marcado de los ácidos nucleicos de interés pre-marcados, 17 ES 2 367 573 T3 la purificación de los ácidos nucleicos de interés marcados o pre-marcados, y/o la detección de los ácidos nucleicos de interés marcados e hibridados en sondas de captura. 5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la superficie interna del recipiente o el soporte sólido introducido en este recipiente están constituidas por funciones carboxílicas y/o sulfónicas. 6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los ácidos nucleicos de interés están constituidos por ácidos nucleicos y/o fragmentos de ácidos nucleicos. 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque los ácidos nucleicos y/o los fragmentos de ácidos nucleicos están constituidos por ADN, ARN, polímeros quiméricos de ADN-ARN. 8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque los ácidos nucleicos y/o los fragmentos de ácidos nucleicos están constituidos por ADN, ARN, polímeros quiméricos de ADN-ARN, que contienen al menos un nucleótido de tiofosfato, un LNA, un 2'-O-Me y/o un derivado de metilfosfonato. 9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque, previamente a la etapa a), definida en las reivindicaciones 1 ó 2, la muestra biológica es tratada de acuerdo con al menos una de las siguientes etapas: la transferencia desde otro recipiente de reacción aguas arriba, la lisis del material biológico complejo, contenido por la muestra biológica, para hacer accesibles a los ácidos nucleicos, la extracción de los ácidos nucleicos a partir del material biológico complejo, la amplificación específica de los ácidos nucleicos de interés, la fragmentación de dichos ácidos nucleicos de interés o amplicones, y/o la transcripción, o la retrotranscripción de un ácido nucleico de interés, sin fenómeno de amplificación notable. 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la etapa f), definida en las reivindicaciones 1 ó 2, viene seguida por al menos una etapa posterior siguiente: la transferencia a otro recipiente de reacción aguas abajo, el marcado de los ácidos nucleicos pre-marcados, la purificación de los ácidos nucleicos marcados o pre-marcados, la detección de los ácidos nucleicos marcados o pre-marcados, hibridados a sondas de captura, la transcripción, o la retrotranscripción de un ácido nucleico de interés, sin fenómeno de amplificación notable, y/o la detección en fase homogénea de los ácidos nucleicos marcados o pre-marcados, con o sin utilización de sondas de detección. 18 ES 2 367 573 T3 19 ES 2 367 573 T3 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción ES 2 367 573 T3 EP 0329198 A [0008] US 6083708 A [0025] EP 0302175 A [0008] WO 0040590 A [0026] EP 0097373 A [0008] WO 9805766 A [0026] EP 0063879 A [0008] WO 0144506 A [0026] US 5449767 A [0008] FR 2607507 A [0032] US 5328824 A [0008] US 4683195 A [0032] WO 9316094 A [0008] US 4683202 A [0032] DE 3910151 A [0008] US 4800159 A [0032] EP 0567841 A [0008] EP 0569272 B [0032] EP 0286898 A [0008] EP 0201184 A [0032] WO 02090319 A [0011] WO 9001069 A [0032] FR 0450600 [0012] WO 9006995 A [0032] US 6376179 A [0015] WO 9102818 A [0032] WO 0144507 A [0015] US 5399491 A [0032] WO 0007982 A [0018] [0019] [0026] WO 0060049 A [0036] FR 9810084 [0024] WO 0005338 A [0036] WO 9508000 A [0024] [0026] WO 9953304 A [0036] EP 0561722 A [0025] WO 9915621 A [0036] EP 0669991 A [0025] US 5234809 A [0037] [0044] WO 0192361 A [0025] [0026] US 4672040 A [0038] EP 0827552 A [0025] US 5750338 A [0038] US 4507466 A [0025] WO 9745202 A [0038] US 4568737 A [0025] WO 9935500 A [0038] Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción Jencks W.P. et al. J. Amer. Chem Soc., Steininger C. et al. Effectiveness of Reverse 1960, vol. 82, 1778-1 785 [0009] Transcription-PCR, Virus Isolation, ans Reporter groups for the analysis of nucleic Enzyme-linked lmmunosorbent Assay for acid structure. ODonnel; Mc Laughlin. diagnosis of Influenza A Virus Infection in Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids. Oxford different Age Groups. J. Clin. Microbiol., 2002, University Press, 1996, 216-243 [0009] vol. 40 (6), 2051-2056 [0065] Randolph J.B. Nucleic Acids Res., 1997, A. Troesch et al. Mycobacterium species vol. 25 (14), 2923-2929 [0018] identification and rifampin resistance testing J. Histochem. Cytochem., 1997, vol. 45, 481- with high-density DNA probe arrays. J. Clin. 491 [0024] Microbiol., 1999, vol. 37, 49-55 [0072] M. Egholm et al. J. Am. Chem. Soc., 1992, A. Troesch et al. Mycobacterium species vol. 114, 1 895-1897 [0032] identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol., 1999, vol. 37, 49-55 [0106] 21