PROCEDIMIENTO DE LISIS CELULAR DE PROCARIOTAS O DE EUCARIOTAS O DE LISIS CELULAR SIMULTÁNEA DE PROCARIOTAS O DE EUCARIOTAS.

Procedimiento de lisis celular de procariotas o de eucariotas o de lisis celular simultánea de procariotas o de eucariotas El presente invento se refiere a unos procedimientos de lisis universal adaptados a la lisis simultánea de procariotas, para el vórtice mecánico. El vórtice mecánico ya ha sido descrito en una solicitud de patente anterior de la parte solicitante. Se trata de la solicitud WO-A-99/15621 que trata de un procedimiento para lisar una muestra biológica que comprende al menos un microorganismo bien de tipo bacteria, o de tipo levadura. Los procedimientos de lisis difieren en el diámetro de las bolas, que está comprendido entre 90 y 150 m, preferiblemente de 100 m, para las bacterias, y que es de 500 m para las levaduras. Hay que tener en cuenta que en esta solicitud de patente se han utilizado mezclas de bolas de zirconio de 100 m y de 500 m de diámetro, con una relación del 50% para cada tipo de bolas (véanse las figuras 1 y 2 del protocolo G) con el fin de lisar las bacterias de Stanphylococcus epidermidis. Los resultados obtenidos con las relaciones de bolas de diferentes diámetros, sin ser malos, son inferiores a: - los obtenidos con bolas de vidrio de 100 m de diámetro (protocolo D), o - los obtenidos con bolas de zirconio de 100 m de diámetro (protocolo E). No obstante, la parte solicitante ha continuado sus trabajos en este campo de la técnica y ha puesto de manifiesto protocolos de lisis independiente de la clase de microorganismos ya se trate de procariotas (bacterias) o de eucariotas (levaduras) o de una mezcla de eucariotas y de procariotas. Estos protocolos, denominados universales, permiten una eficacia tan importante como la de las lisis asociadas únicamente a las bacterias o únicamente a las levaduras, tales como han sido desarrolladas en el estado de la técnica anteriormente expuesto. De manera sorprendente y en ciertos casos, se comprueba que estos protocolos universales son a menudo más eficaces que las lisis del estado de la técnica. A tal fin, el presente invento se refiere a un procedimiento de lisis celular de procariotas o de eucariotas o de lisis celular simultánea de procariotas y de eucariotas, por vórtice mecánico, que consiste en adaptar al menos tres de los parámetros siguientes: - un porcentaje en masa de bolas activas de pequeño diámetro con respecto a la masa de las bolas activas de gran diámetro inferior o igual al 50%, y/o - una masa total de bolas lisantes, que comprende una mezcla o sin bolas de pequeño diámetro y/o de bolas de gran diámetro, comprendido entre el 50 y el 100% con respecto a la masa total de la muestra biológica tratada, y/o - una duración de la lisis comprendida entre 10 y 20 min, y/o - un número de bolas de vidrio no lisantes pero de arrastre de las bolas lisantes inferior a siete (7), y/o - un número de bolas de hierro no lisantes pero de arrastre de las bolas lisantes comprendido entre cinco (5) y quince (15). Según una variante preferible de realización, las bolas lisantes son de vidrio. Las bolas lisantes de pequeño diámetro tienen un diámetro comprendido entre 90 y 150 m y preferiblemente de aproximadamente 100 m, y las bolas lisantes de gran diámetro tienen un diámetro comprendido entre 400 y 600 m y de forma preferida de aproximadamente 500 m. Más particularmente, el procedimiento consiste en efectuar una lisis por vórtice mecánico según los parámetros siguientes: - una duración de la lisis de 11 a 20 min, preferiblemente de 15 a 20 min, e incluso más preferiblemente de 20 min, - un porcentaje de bolas de 100 m de diámetro inferior al 50%, preferiblemente inferior al 30%, e incluso más preferiblemente del 20%, - una masa total de bolas lisantes superior al 60%, preferiblemente superior al 80%, %, e incluso más preferiblemente del 100% de la masa total de la muestra biológica, y - un número de bolas de vidrio inferior a siete (7), preferiblemente igual a uno (1). Las figuras que se adjuntan son dadas a título de ejemplo explicativo y no tienen carácter limitativo alguno. Ellas permitirán comprender mejor el invento. La Figura 1 representa un ejemplo de curvas de isorrespuestas en el marco de un enfoque MRE. La Figura 2 represente curvas de isorrespuestas en el marco de la lisis por vórtice mecánico de levaduras. Finalmente, la Figura 3 representa curvas de isorrespuestas en el marco de la lisis por vórtice mecánico de bacterias. 2 I. Material y métodos Como se ha expuesto anteriormente, en el estado de la técnica se conocen tres protocolos. Se trata de la sonicación del vórtice mecánico y del vórtice magnético. Cada uno de ellos ha sido definido para las bacterias y para las levaduras de forma independiente. Los parámetros así definidos, que se presentan en el cuadro 1, están en relación con parámetros considerados correctos del estado de la técnica. Hay que tener en cuenta que el volumen de las muestras biológicas tratadas, independientemente de los protocolos de referencia o de los protocolos según el presente invento, es de 600 l. Protocolo Sonicación Vórtice mecánico Vórtice magnético Factores Diámetros Bacterias Levaduras Bacterias Levaduras Bacterias Levaduras (m) y cantidad de 100 y 0,4 500 y 0,3 100 y 0,6 500 y 0,5 100 y 0,6 500 y 0,5 bolas activas Número de bolas de vidrio (3mm de diámetro) Número de bolas de hierro (2mm de diámetro) Duración de la lisis - - 6 - - - - 10 10 15 min 2 min 12 min 10 min 12 min Cuadro 1: Protocolos de la lisis según el estado de la técnica, llamados protocolos de referencia Las bolas activas denominadas lisantes están constituidas por bolas que permiten la lisis de los microorganismos. 15 Se trata de bolas de pequeños diámetros (100 o 500 m). Conviene advertir que las bolas de vidrio de 100 m de diámetro han sido obtenidas de Masteau et Lamarié, Paris, Francia, con la referencia Via 1, y que las bolas de vidrio de 500 m de diámetro proceden de la sociedad Sigma, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos, con la referencia 8772. 20 Por el contrario, las otras bolas de vidrio (3 mm de diámetro) y de hierro (2 mm de diámetro), utilizadas para los vórtices mecánico y magnético, tiene como objeto poner en movimiento las bolas activas después de una agitación. Se denominan bolas pasivas o indirectamente activas, mediante las bolas lisantes anteriormente definidas. Las bolas de vidrio de 3 mm de diámetro han sido compradas a Prolabo (Fontenay-sous-Bois), Francia) con la referencia 00680032, y es Bennk Elektronik (Norderstadt, Alemania) la que ha suministrado las bolas de hierro de 2 mm de 25 diámetro, con la referencia 050-330. Hay que tener en cuenta que es posible utilizar bolas de hierro recubiertas con un material biológicamente inerte, tal como plástico o vidrio, con objeto de aislar el hierro e impedir su precipitación por medio de sales, que es a menudo incompatible con las operaciones de amplificación posteriores de los ácidos nucleicos liberados por la lisis. Los resultados obtenidos con los procedimientos según el invento se compararán a continuación con los resultados obtenidos por medio de los procedimientos de referencia antes descritos. El objeto de un protocolo universal de lisis es permitir la detección, después de la lisis, de microorganismos 35 responsables de infecciones de fluidos biológicos estériles (líquido cefalorraquídeo, orina y sangre) sin saber a priori si se trata de microorganismos procariotas (bacterias) o eucariotas (levaduras). A) Metodología de la investigación experimental 40 Un enfoque para la Metodología de la Investigación Experimental (MRE) ha sido utilizado para el vórtice mecánico. ES 2 367 553 T3 El estudio MRE consta de dos etapas. En una primera, y para diferentes factores, se han definido una zona óptima propia de las levaduras y una zona óptima propia de las bacterias. Esta zona óptima se define como la que proporciona una eficacia de lisis equivalente o superior a la obtenida con el protocolo de referencia. En una segunda etapa, y si es posible, se define una zona denominada de compromiso, que corresponde a la intersección de la zona óptima de bacterias con la zona óptima de levaduras. 3 El MRE es un estudio matemático que consiste en establecer un modelo de un fenómeno biológico, en caso de producirse la lisis, mediante una ecuación matemática (a menudo una ecuación matemática polinómica de segundo grado) del tipo: R = aX + bY + cX 2 + dY 2 + eXY + F, en donde R es la respuesta experimental que representa la eficacia de la lisis, X e Y son factores que influyen en la lisis tales como la duración de la misma como el tamaño de las bolas, y a, b, c, d, e y f son coeficientes. Esta ecuación puede representarse en forma de curvas denominadas isorrespuestas que permiten ver cómo varía la respuesta en función de los valores tomados por los diferentes factores. La Figura 1 ofrece un ejemplo de curvas de isorrespuestas. Según esta Figura 1... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de lisis celular de microorganismos procariotas o eucariotas de lisis celular simultánea de microorganismos procariotas y eucariotas, que consiste en efectuar un vórtice mecánico adoptando los siguientes parámetros: - un porcentaje en masa de bolas lisantes de pequeño diámetro con respecto a las bolas lisantes de gran diámetro inferior o igual al 50%, - una masa total de bolas lisantes, que comprende una mezcla de bolas de pequeño diámetro y de bolas de gran diámetro, comprendida entre el 50% y el 100% con respecto a la masa total de la muestra biológica tratada, - una duración de lisis comprendida entre 10 y 20 min, y - un número de bolas de arrastre, de vidrio, inferior a siete (7), y - un número de bolas de arrastre de las bolas lisantes, de vidrio, inferior a siete (7), en el que las bolas lisantes de pequeño diámetro tienen un diámetro comprendido entre 90 y 150 m, y preferiblemente cercano a 100 m, y estando las bolas lisantes de gran diámetro comprendidas entre 400 y 600 m, y preferiblemente cercano a 500 m. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque las bolas lisantes son de vidrio. 3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque consiste en efectuar un vórtice mecánico según los siguientes parámetros: - una duración de lisis de 11 a 20 min, preferiblemente de 15 a 20 min, e incluso más preferiblemente de 20 min, - un porcentaje de bolas de 100 m de diámetro inferior al 50%, preferiblemente inferior al 30%, e incluso más preferiblemente del 20%, - una masa total de bolas lisantes superior al 60%, preferiblemente superior al 80%, e incluso más preferiblemente del 100% de la masa total de la muestra biológica tratada, y - un número de bolas de vidrio inferior a siete (7), preferiblemente igual a uno (1). 9 ES 2 367 553 T3 Fig 1 ES 2 367 553 T3 11 Fig. 2 Fig. 3