Un lipopolímero catiónico no tóxico biodegradable que comprende una polietilenimina (PEI) ramificada,

un ancla lipídica seleccionada de entre el colesterol y ácidos grasos con una cadena C12 a C18, y un enlazante biodegradable; el enlazante biodegradable une de manera covalente la PEI ramificada y el ancla lipídica, y en al menos una amina primaria de la PEI ramificada se injerta un polialquilenglicol que tiene un peso molecular comprendido entre 0,5 y 20 KDaltons, y el lípido catiónico contiene al menos un 50% de grupos amino libres no sustituidos funcionales

5 ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una sustancia bioactiva. Más concretamente, se refiere a una composición y a un método para la provisión de sustancias bioactivas, como, por ejemplo, ADN, ARN, oligonucleótidos, proteínas, péptidos y fármacos, mediante la facilitación de su transporte transmembranal o mediante la mejora de su adhesión 10 a superficies biológicas. Se refiere en especial a un novedoso lipopolímero catiónico conforme a la reivindicación 1 que comprende una polietilenimina (PEI) ramificada, un ancla lipídica derivada del colesterol, y un enlazante biodegradable que une mediante enlace covalente la PEI ramificada y el ancla lipídica derivada del colesterol. Un ejemplo de un novedoso lipopolímero tal es poli{(etilenimina)-co-[N-2-aminoetil)etilenimina]-co-[N-(Ncolesteriloxicarbonil-(2-aminoetil)etilenimina]} (de aquí en adelante, denominada “PEACE”). Los lipopolímeros catiónicos de la presente invención se pueden utilizar en la administración de fármacos y son especialmente útiles para administrar un ácido nucleico o cualquier sustancia bioactiva aniónica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Entre los portadores de genes empleados hasta ahora se incluyen los sistemas víricos (retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, o virus herpes simples) o no víricos (liposomas, polímeros, péptidos, precipitación con fosfato cálcico y electroporación). Se ha demostrado que los vectores víricos tienen una elevada eficiencia transfectora en comparación con los vectores no víricos, pero a causa de diversas desventajas, como, por ejemplo, el hecho de que sólo se dirigen contra células en división, así como el hecho de que el ADN se inserta al azar, junto con su baja capacidad para transportar genes terapéuticos de gran tamaño, el riesgo de replicación, y la posible reacción inmune del huésped, su uso in vivo se ve enormemente limitado.

En comparación con los vectores víricos, los vectores no víricos son fáciles de fabricar y la probabilidad de que generen reacciones inmunes es menor; además, con ellos no se requiere replicación. Cada vez se ha prestado mayor atención al desarrollo de vectores de transferencia génica no víricos seguros y eficientes, que son o 40 polímeros policatiónicos o lípidos catiónicos. Se han introducido, para uso en administración de genes, polímeros policatiónicos tales como la poli-L-lisina, la poli-L-ornitina y la polietilenimina (PEI), que interaccionan con el ADN formando complejos poli-iónicos. Asimismo, se ha constatado que diversos lípidos catiónicos forman lipoplejos con el ADN y que inducen la transfección eficiente de diversas células eucarióticas. De entre tales tipos de vectores sintéticos, se utilizan ampliamente los lípidos catiónicos porque resulta posible diseñar y sintetizar numerosos 45 derivados que son excelentes en los aspectos de eficiencia en la transfección, biodegradabilidad y baja toxicidad. De entre ellos, se sabe que los derivados catiónicos del colesterol son muy útiles dada su elevada eficiencia de transfección in vitro. Aunque aún no se ha aclarado del todo el mecanismo de esta actividad transfectora, probablemente incluye la unión del complejo ADN/lípido a la superficie celular mediante el exceso de cargas positivas del complejo. Probablemente, los complejos unidos a la superficie celular se internalizan y el ADN se libera

50 en el citoplasma de la célula desde un compartimento endocítico.

Sin embargo, no es posible aplicar directamente la tecnología de transfección in vitro a aplicaciones in vivo. En relación con el uso in vivo, el mayor problema que se produce con los lípidos diéter, tales como el cloruro de N-[1(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o la lipofectina, es que no son metabolitos naturales del

55 organismo, y por ello no son biodegradables y resultan tóxicos para las células. Además, se ha notificado que la transfección de lípidos catiónicos es inhibida por los factores presentes en el suero, y por ello, resulta ser un método ineficaz para la introducción de material genético en las células in vivo.

Un reactivo de transfección idóneo debería mostrar un alto nivel de actividad transfectora sin que sea necesario

60 realizar ninguna manipulación mecánica ni física de las células o tejidos. El reactivo debería ser no tóxico, o tener una toxicidad mínima, a la dosis eficaz. Además, a fin de evitar efectos secundarios adversos duraderos en las células tratadas, debería ser biodegradable. Cuando se utilizan transportadores de genes para la administración de ácidos nucleicos in vivo, es esencial que los transportadores de genes en sí sean no tóxicos y que se degraden formando productos no tóxicos. Para minimizar la toxicidad del transportador de genes intacto y de los productos de

degradación de éste, el diseño de los transportadores de genes debe basarse en metabolitos que se den naturalmente.

En la Patente estadounidense Nº 5283185, concedida a Epand et al (de aquí en adelante, la “patente 185”), se describe un método para facilitar la transferencia de ácidos nucleicos a células, y dicho método comprende la preparación de una dispersión lipídica mixta del lípido catiónico 3β[N-(N',N”-dimetilaminoetano)-carbamoíl]colesterol (DC-colesterol) con un colípido en un solvente transportador adecuado. El método descrito en la patente 185 incluye el uso de un solvente halogenado para preparar una suspensión de liposomas. En las aplicaciones farmacéuticas, no es posible eliminar de una manera práctica los residuos de los solventes halogenados de una preparación, una vez introducidos. En la Patente estadounidense Nº 5753262 (de aquí en adelante, la “patente 262”), se describe el uso de una sal ácida del lípido 3β[N-(N',N”-dimetilaminoetano)-carbamoíl]colesterol (DC-colesterol) y un lípido coadyuvante (“helper”), tal como la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o la dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), para producir una transfección eficaz in vitro. Además, estos lípidos catiónicos se han mostrado menos eficientes en la transferencia de genes in vivo.

Dada su magnitud inferior a la de las células, se ha formulado la hipótesis de que las nanopartículas mejorarían la captación en las interfaces celulares, lográndose así, en el verdadero sentido del término, un “efecto farmacológico local”. Asimismo, se ha formulado la hipótesis de que se produciría una mayor captación celular de los fármacos contenidos en nanopartículas (gracias a la endocitosis), en comparación con los fármacos libres correspondientes. Se han investigado las nanopartículas como sistemas de transporte de fármacos para situar sustancias terapéuticas en los tumores en el tratamiento del cáncer, y para administrar fármacos (sustancias antivirales o antibacterianas) a dianas intracelulares, para dirigir fármacos al sistema reticuloendotelial (en caso de infecciones parasitarias), como adyuvante inmunológico (por vía oral y subcutánea), para la administración de fármacos oculares con acción sostenida, y para el tratamiento farmacológico sistémico prolongado.

En vista de lo expuesto hasta aquí, es evidente que resulta deseable la provisión de un transportador de genes que sea no tóxico, biodegradable y capaz de formar nanopartículas, liposomas o micelas para el tratamiento génico y farmacológico. El novedoso transportador de genes de la presente invención comprende un novedoso lipopolímero catiónico que comprende una polietilenimina (PEI) ramificada, un ancla lipídica derivada del colesterol, y un enlazante biodegradable que une de manera covalente la PEI ramificada y el ancla lipídica derivada del colesterol,... [Seguir leyendo]

1. Un lipopolímero catiónico no tóxico biodegradable que comprende una polietilenimina (PEI) ramificada, un ancla lipídica seleccionada de entre el colesterol y ácidos grasos con una cadena C12 a C18, y un enlazante biodegradable; el enlazante biodegradable une de manera covalente la PEI ramificada y el ancla lipídica, y en al menos una amina primaria de la PEI ramificada se injerta un polialquilenglicol que tiene un peso molecular comprendido entre 0,5 y 20 KDaltons, y el lípido catiónico contiene al menos un 50% de grupos amino libres no sustituidos funcionales.

2. El lipopolímero catiónico de la reivindicación 1, en el que la PEI ramificada tiene un peso molecular promedio de 600 a 25000 Daltons.

3. El lipopolímero catiónico de la reivindicación 1, en el que la proporción molar entre PEI ramificada y ancla lipídica está comprendida, preferiblemente, en un intervalo de 1:1 a 1:20.

4. El lipopolímero catiónico de la reivindicación 1, en el que el enlazante biodegradable es un enlace éster.

5. El lipopolímero catiónico poli{(etilenimina)-co-[N-2-aminoetil)etilenimina]-co-[N-(N-colesteriloxicarbonil-(2aminoetil)etilenimina]} (“PEACE”).

6. El lipopolímero catiónico de la reivindicación 1, que comprende además una fracción de dirección a dianas seleccionada del grupo que comprende transferrina, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato, manosa, LewisX y sialil-LewisX, N-acetillactosamina, galactosa, lactosa, trombomodulina, sustancias fusogénicas tales como la polimixina B y la hemaglutinina HA2, sustancias lisosomotrópicas, y señales de localización del núcleo (SLN) tales como el antígeno

T.

7. El lípido catiónico de la reivindicación 6, en el que la fracción de dirección a dianas es galactosa o lactosa.

8. El polímero catiónico de la reivindicación 6, en el que dicha fracción de dirección a dianas es una sustancia fusogénica seleccionada del grupo que comprende polimixina B y hemaglutinina HA2.

9. El lipopolímero catiónico de la reivindicación 6, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG).

10. Una composición farmacéutica que comprende una sustancia bioactiva y un lipopolímero catiónico no tóxico biodegradable conforme a una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha sustancia bioactiva es un ácido nucleico, una proteína o un fármaco aniónico.

12. La composición de la reivindicación 10, en la que la proporción de carga entre lipopolímero catiónico y ácido nucleico (+/-) está comprendida en el intervalo de 5:1 a 1:1.

13. La composición de la reivindicación 10, que comprende además un lípido coadyuvante seleccionado del grupo que comprende dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), oleoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (OPE), difitanoilfosfatidiletanolamina (difitanoíl-PE), disteroíl-, -palmitoíl-, y -miristoilfosfatidiletanolamina, así como sus derivados N-metilados de 1 a 3 veces.

14. La composición de la reivindicación 13, en la que la proporción molar entre lipopolímero catiónico y lípido coadyuvante está comprendida en el intervalo de 4:1 a 1:2.

15. Un lipopolímero catiónico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en la administración de una sustancia bioactiva a un animal de sangre caliente.

16. Una composición conforme a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para uso en el tratamiento del cáncer, de las enfermedades infecciosas, de las enfermedades inflamatorias y de las enfermedades genéticas hereditarias.