UTILIZACIÓN DE CONJUGADOS DE AMATOXINAS O FALOTOXINAS CON MACROMOLÉCULAS PARA LA TERAPIA TUMORAL Y DE LA INFLAMACIÓN.

Utilización de conjugados de amatoxinas o falotoxinas con macromoléculas para la terapia tumoral y de la inflamación. Las amatoxinas (-amanitina, ß-amanitina, amanina) son péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos. Pueden aislarse del hongo Amanita phalloides o bien elaborarse a partir de unidades estructurales por síntesis. Las amatoxinas inhiben de forma específica la ARN polimerasa II dependiente de ADN de las células de los mamíferos y, debido a ello, detienen la transcripción y la biosíntesis de las proteínas de las células afectadas. La inhibición de la transcripción provoca la detención del crecimiento y la proliferación de la célula. A pesar de carecer de enlaces covalentes, el complejo formado entre la amanitina y la ARN polimerasa II es muy fuerte (KD = 3 nM). La disociación de la amanitina de la enzima es un proceso muy lento, que hace que la recuperación de la célula afectada sea poco probable. Cuando en una célula la inhibición de la transcripción dura demasiado, la célula sufre una muerte celular programada (apoptosis), tal y como se demuestra en cultivos de células Jurkat incubadas con -amanitina o, con mucha mayor eficacia, en células Jurkat incubadas con oleato de O-metil--amanitina, un compuesto que consigue atravesar la membrana (resultados propios, no publicados). Las falotoxinas (faloidina, falacidina o aminofaloidina) son péptidos cíclicos compuestos de 7 aminoácidos. Se unen específicamente a la proteína del citoesqueleto actina en su forma polimérica (microfilamentos). Impiden así la despolimerización de los microfilamentos y alteran el funcionamiento del citoesqueleto de actina. Dicho citoesqueleto es una densa malla de microfilamentos que, bajo el control de las proteínas asociadas a la actina, está sometido a rápidos ciclos de estructuración y desestructuración fundamentales para los procesos dinámicos como la división y la migración celular. Asimismo, se cree que la invasión por células metastásicas es un proceso dependiente de la actina. En las células cancerígenas, las perturbaciones estructurales y funcionales del citoesqueleto de actina pueden estar relacionadas con mayores tasas de proliferación y un movimiento no controlado. Las moléculas que actúan sobre el citoesqueleto de las células tumorales inhiben la división celular y provocan la muerte programada de la célula. Las falotoxinas que pueden atravesar la membrana como el oleato de faloidina, desencadenan la apoptosis en cultivos de células Jurkat, como se ha demostrado en el laboratorio en el contexto de la presente invención (no publicado). Los índices de penetración de las amatoxinas y falotoxinas naturales a través de las membranas celulares son bajos. Por este motivo, la mayoría de los tipos de células de mamíferos están protegidos frente a las amatoxinas y las falotoxinas. No obstante, las células parenquimatosas del hígado poseen sistemas de transporte (proteínas transportadoras de aniones orgánicos, OATP), que facilitan la captación de las toxinas en los hepatocitos. La presencia de estos sistemas de transporte hepáticos explica por qué en los casos de envenenamiento en seres humanos por ingesta de amanita las células afectadas sean sobre todo los hepatocitos, y que los hepatocitos de ratón, rata y ser humano, entre otros, fueran hasta el momento los modelos más utilizados para estudiar las actividades biológicas de las amatoxinas y las falotoxinas. Una vez declaradas como hepatotoxinas, la manifiesta toxicidad hepática de las amatoxinas y las falotoxinas, ha hecho desestimar todos los planes encaminados a utilizar las toxinas como fármacos en la terapia tumoral. Según la presente invención, las amatoxinas y las falotoxinas se pueden convertir en medicamentos para la terapia tumoral uniéndolas de forma covalente a macromoléculas. Los conjugados de toxinas resultantes están compuestos de 2 componentes. Conjugados portador-toxina La toxina se selecciona de entre las amatoxinas. Las amatoxinas son péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos, aisladas del hongo Amanita phalloides y descritas en la ref. (Wieland, T. y Faulstich H., Crit. Rev. Biochem. 5, (1978), 185-260); además, todos sus derivados químicos; además, todos sus análogos semisintéticos; además, todos sus análogos sintéticos obtenidos a partir de unidades estructurales según la estructura principal de los compuestos naturales (cíclica, 8 aminoácidos). Desde el punto de vista funcional, las amatoxinas se definen como péptidos o depsipéptidos que inhiben la ARN polimerasa II de mamífero. Las amatoxinas preferidas son las que presentan un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxílico, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo de captación de tiol) que pueda reaccionar con moléculas conectoras o portadoras. Otras toxinas conocidas en la técnica son las falotoxinas. Las falotoxinas son péptidos cíclicos compuestos por 7 aminoácidos, aisladas a partir del hongo Amanita phalloides y descritas en la ref. (Wieland, T. y Faulstich H., Crit. Rev. Biochem. 5, (1978), 185-260). Además, todos sus derivados químicos; además, todos sus análogos semisintéticos; además, todos sus análogos sintéticos obtenidos a partir de unidades estructurales según la estructura principal de los compuestos naturales (cíclica, 7 aminoácidos). En términos funcionales, las falotoxinas se definen como péptidos o depsipéptidos que se unen a la actina polimérica e inhiben la despolimerización de los microfilamentos. Las falotoxinas preferidas son las que presentan un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxílico, un grupo amino, un grupo tiol o un grupo de captación de tiol) que puede reaccionar con moléculas 2 E06010902 03-11-2011   conectoras o portadoras. El portador comprende un anticuerpo monoclonal específico de tumor que se une a las células tumorales o es absorbido por éstas. Los portadores preferidos tienen una masa molar de entre 20 y 300 kDa. La relación molar preferida toxina : portador es de 1-15 : 1. La vía de administración preferida de los conjugados de toxinas es intravenosa o intraperitoneal. La aplicación preferida de los conjugados de toxinas es en tratamientos antitumorales y antinflamatorios. La dosis preferida en seres humanos es de 10-100 µg/kg de peso corporal. La aplicación preferida es de 1 mg de toxina /100 ml al 0,9 % de NaCl. Los conjugados de toxinas también se utilizan como herramientas en la investigación de la biología celular. Tanto las amatoxinas como las falotoxinas ejercen su actividad tóxica, como se ha descrito anteriormente, exclusivamente en el citoplasma o en el núcleo de las células, por lo que tienen que atravesar la membrana celular. Por este motivo, los efectos tóxicos en la célula se utilizan para indicar la interiorización de la macromolécula utilizada en dicha célula. También se dan a conocer conjugados de amatoxinas con albúmina. Preferentemente afectan a las células consumidoras de proteínas, como las células sinusoidales del hígado o los macrófagos (Barbanti-Brodano y Fiume, Nature New Biol. 1973, 243, 281-3). En combinaciones de macrófagos y linfocitos, por ejemplo, la albúmina-ß- amanitina provocaba la extinción selectiva de los macrófagos y dejaba los linfocitos intactos. Por otro lado, la albúmina-ß-amanitina era tolerada en ratas en concentraciones que permitían la formación de anticuerpos específicos contra la amanitina en dichos roedores. En experimentos similares, se produjeron anticuerpos específicos contra la amanitina en conejos mediante el uso de conjugados de fetuína-ß-amanitina. Las proporciones de toxina:portador utilizadas en la técnica anterior fueron 3-17:1. Se ha descubierto que la toxicidad de los conjugados de albúmina-amanitina puede reducirse en gran medida modificando las condiciones de unión. Se procedió a preparar un conjugado de albúmina de suero humano y ßamanitina utilizando un éster de ß-amanitina-N-hidroxisuccinimida, sin carbodiimidas ni el método del anhídrido mixto, junto con una proporción mucho menor de toxina:albúmina. Cuando la concentración de amanitina (c) en estos conjugados de albúmina se determinó mediante espectrometría u.v. utilizando la fórmula: camanitina [g/ml]=1/13,5 × (E310-0.05 E280) × 918 (en la que E310 y E280 son los valores de absorbancia del conjugado de albúmina a 300 nm y 280 nm, respectivamente), se descubrió que, como promedio, alrededor de 1 molécula de toxina se unía a la albúmina. Este procedimiento, junto con el especial cuidado en evitar la desnaturalización y/o la dimerización del componente de la albúmina, redujo la toxicidad de los nuevos conjugados de amanitina-albúmina en ratones en un factor de 10, respecto a anteriores preparados de conjugados de albúmina y ß-amanitina. Para la preparación de un conjugado de amatoxina-albúmina, se disolvieron 2 µmol de ß-amanitina (secada al... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de la fórmula general portador-toxina, en el que - la toxina es una amatoxina; y - el portador comprende un anticuerpo monoclonal específico de tumor que se une a o es absorbido por las células tumorales; en el que el conjugado puede obtenerse haciendo reaccionar el anticuerpo monoclonal específico de tumor con 10 a 30 equivalentes de éster de ß-amanitina-N-hidroxisuccinimida durante 16 horas a 4ºC. 2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el portador presenta una masa molar de 20 a 300 kDa. 3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la proporción molar de toxina:portador se encuentra entre 1:1 y 15:1. 4. Composición que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en combinación con compuestos anticancerosos adicionales. 5. Composición según la reivindicación 4, en la que los compuestos anticancerosos adicionales son seleccionados de entre el grupo constituido por análogos de nucleósidos, taxol y tecanos. 6. Composición farmacéutica que comprende: (a) el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o (b) la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. 7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para su utilización terapéutica. 8. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para su utilización en el tratamiento del cáncer. 9. Utilización del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. 10. Utilización del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en ensayos de biología celular para indicar la interiorización del conjugado, que comprende las etapas que consisten en: - incubar in vitro dicho conjugado en presencia de células diana; y - determinar la aparición de episodios tóxicos en la célula. 11. Utilización según la reivindicación 10, en el que el episodio tóxico es la apoptosis. 6 E06010902 03-11-2011   7 E06010902 03-11-2011   8 E06010902 03-11-2011   9 E06010902 03-11-2011   E06010902 03-11-2011   11 E06010902 03-11-2011