Un fragmento de proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1 b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1 c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1 d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1 e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1 f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1 g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1 h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de sustancias antiinflamatorias que actúan inhibiendo la adhesión de leucocitos a células endoteliales. Más particularmente, la presente invención se refiere a un nuevo ligando para la proteína de adhesión de mamíferos conocida como “P-selectina”.

Durante la inflamación, los leucocitos se adhieren al endotelio vascular y entran en el tejido subendotelial, una interacción que está mediada por una unión específica de la selectina o de la clase LEC-CAM de proteínas a ligandos en células diana. Dicha adhesión celular mediada por selectina también se produce en trastornos trombóticos y enfermedades parasitarias, y puede estar implicada en la propagación metastásica de células tumorales.

Las proteínas selectinas se caracterizan por un dominio tipo lectina N-terminal, un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico y regiones de homología con proteínas de unión complementarias. Hasta ahora se han identificado tres proteínas selectina humanas, E-selectina (antiguamente ELAM-1), L-selectina (antiguamente LAM-1) y P-selectina (antiguamente PADGEM o GMP-140). La E-selectina se induce en células endoteliales varias horas después de la activación por citocinas, mediando la interacción dependiente de calcio entre neutrófilos y el endotelio. La L-selectina es el receptor de direccionamiento (homing) de linfocitos y la P-selectina aparece rápidamente en la superficie celular de las plaquetas cuando se activan, mediando la adhesión dependiente de calcio de neutrófilos o monocitos a plaquetas. La P-selectina también se encuentra en los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales; tras su liberación de estas vesículas la P-selectina media la unión tempana de neutrófilos al endotelio estimulado con histamina o trombina.

Se cree que las selectinas median la adhesión a través de interacciones específicas con ligandos presentes en la superficie de células diana. Generalmente, los ligandos de selectinas están compuestos al menos en parte por un resto carbohidrato. Por ejemplo, la E-selectina se une a carbohidratos que tienen la estructura terminal

**(Ver fórmula)**

y también a carbohidratos que tienen la estructura terminal

**(Ver fórmula)**

donde R es el resto de la cadena de carbohidrato. Estos carbohidratos son antígenos de grupo sanguíneo conocidos y se denominan comúnmente Lewisx sialilado y Lewisa sialilado, respectivamente. La presencia del antígeno Lewisx sialilado solo en la superficie de una célula endotelial puede ser suficiente para promover la unión a una célula que exprese E-selectina. La E-selectina también se une a carbohidratos que tienen las estructuras terminales

**(Ver fórmula)**

Como con la E-selectina, cada selectina parece unirse a una variedad de carbohidratos con afinidades variables. La intensidad del acontecimiento adhesivo mediado por selectina (afinidad de unión) también puede depender de la densidad del carbohidrato y de la densidad de la selectina en la superficie celular.

La P-selectina se une a carbohidratos que contienen la forma no sialilada del antígeno de grupo sanguíneo Lewisx y con mayor afinidad a Lewisx sialilado. La P-selectina también puede reconocer sulfatidas, que son galactosil ceramidas 3sulfatadas heterogéneas, aisladas de células mieloides y tumorales por extracción de lípidos. Sin embargo, la unión de células que llevan P-selectina a células que llevan ligandos de P-selectina se suprime cuando las células que llevan ligandos se tratan con proteasas, indicando que el ligando de P-selectina puede ser una glicoproteína.

Se han identificado recientemente dos supuestos ligandos de glicoproteína para la P-selectina, uno de los cuales se ha purificado parcialmente, (Moore et al., J. Cell Biol. 118, 445-456 (1992)). Sin embargo, no se describe la composición de aminoácidos ni la secuencia aminoácidos de estas glicoproteínas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína ligando de P-selectina que es un fragmento de la proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1;

c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1;

d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1;

e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1;

f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1;

g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1;

h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno de los fragmentos de ligando de P-selectina de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo que reacciona específicamente con un ligando de P-selectina, en el que la secuencia de la proteína ligando de P-selectina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y

b) del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEC ID Nº: 1.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido que codifica un ligando de P-selectina que comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con la proteína ligando de P-selectina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una afección caracterizada por una adhesión mediada por P-selectina.

Asimismo, la presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con una proteína ligando de P-selectina para su uso para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades inflamatorias o cáncer.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo de la invención que reacciona específicamente con una proteína ligando de P-selectina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar enfermedades inflamatorias o cáncer.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende:

a) una primera secuencia de aminoácidos seleccionada de: del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y del aminoácido 42 al aminoácido 295 de la SEC ID Nº: 1; y

b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una porción Fc de una inmunoglobulina.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un ADN que codifica la proteína de fusión de la invención.

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere al plásmido que comprende un ADN que codifica una proteína de fusión soluble del ligando de P-selectina-Fc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han identificado y aislado por primera vez un nuevo ácido nucleico y que comprende una secuencia que codifica una proteína que actúa como ligando para P-selectina en células endoteliales humanas y plaquetas. La secuencia de aminoácidos completa de la proteína ligando de P-selectina (es decir, el péptido maduro más la secuencia líder) se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 del aminoácido 1 al aminoácido 402. El análisis de hidrofobicidad y la comparación con patrones de escisión conocidos predicen una secuencia señal de 20 a 22 aminoácidos, es decir, aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 de la SEC ID Nº: 1. La proteína ligando de P-selectina contiene un sitio de escisión PACE (enzima conversora de aminoácidos básicos emparejados) (-Arg-Asp-Arg-Arg-) en los... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de proteína ligando de P-selectina que tiene actividad de ligando de P-selectina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1 b) del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1 c) del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1 d) del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1 e) del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1 f) del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1

g) del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1 h) del aminoácido 1 al aminoácido 310 de la SEC ID Nº: 1

2. El fragmento de la proteína ligando de P-selectina que comprende del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1, en el que una o más de las tirosinas en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 51 está sulfatada.

3. El ligando de P-selectina de la reivindicación 1, en el que el ligando de P-selectina está en forma lineal.

4. El fragmento de ligando P-selectina de la reivindicación 1, en el que el ligando de P-selectina está en forma cíclica.

5. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno de los fragmentos de ligando de P-selectina de la reivindicación 1.

6. Un anticuerpo que reacciona específicamente con el ligando de P-selectina, en el que la secuencia de la proteína ligando de P-selectina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) del aminoácido 42 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y b) del aminoácido 127 al aminoácido 138 de la SEC ID Nº: 1.

7. Un plásmido que codifica un ligando de P-selectina que comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.

8. El plásmido de la reivindicación 7, en el que dicho plásmido es pMT21:PL85.

9. Un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con la proteína ligando de P-selectina, para usarse para el tratamiento de una afección caracterizada por la adhesión mediada por P-selectina.

10. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con la proteína ligando de Pselectina, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una afección caracterizada por una adhesión mediada por P-selectina.

11. Un anticuerpo de la reivindicación 6 que reacciona específicamente con proteína ligando de P-selectina para usar para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades inflamatorias o cáncer.

12. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 6, que reacciona específicamente con proteína ligando de Pselectina, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o diagnosticar enfermedades inflamatorias o cáncer.

13. El anticuerpo de las reivindicaciones 9 u 11 para el uso especificado en la presente memoria, o el uso de las reivindicaciones 10 ó 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. Una proteína de fusión que comprende:

a) una primera secuencia de aminoácidos seleccionada de: del aminoácido 21 al aminoácido 54 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 55 al aminoácido 127 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 128 al aminoácido 267 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 268 al aminoácido 308 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 309 al aminoácido 333 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 334 al aminoácido 402 de la SEC ID Nº: 1; del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1; y del aminoácido 42 al aminoácido 295 de la SEC ID Nº: 1; y

b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de una porción Fc de una inmunoglobulina.

15. La proteína de fusión de la reivindicación 14, en la que la primera secuencia de aminoácidos comprende del aminoácido 43 al aminoácido 56 de la SEC ID Nº: 1.

16. La proteína de fusión de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en la que la inmunoglobulina es una molécula de IgG.

17. La proteína de fusión de la reivindicación 16, en la que la IgG es IgG1.

18. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 15, en la que la inmunoglobulina es una molécula 5 de IgM.

19. La proteína de fusión de la reivindicación 15, en la que una o más tirosinas en el aminoácido 46, aminoácido 48 y/o aminoácido 51 de la primera secuencia de aminoácidos están sulfatadas.

20. Un ADN que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 14 o la reivindicación 15.

21. Un plásmido que comprende un ADN que codifica una proteína de fusión de ligando de P-selectina soluble-Fc. 10 22. El plásmido de la reivindicación 21, en el que el plásmido es pED.PSL.Fc.