Un procedimiento para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de:

aplicar dicha solución a una resina de hidroxiapatita, lavar dicha resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas del factor eluir dicha resina hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, en el que dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en líneas generales a nuevos procedimientos de recuperación y purificación de proteínas y más específicamente a nuevos procedimientos para la recuperación y purificación del factor IX. 5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El advenimiento de la tecnología recombinante ahora permite la producción de elevados niveles de proteínas dentro de células huésped adecuadamente transformadas. Para proteínas secretadas, la purificación de la proteína de interés implica el aislamiento y purificación del medio de cultivo de la célula huésped. Típicamente, el medio de cultivo contiene nutrientes seleccionados (por ejemplo, vitaminas, aminoácidos, cofactores, minerales) y 10 factores de crecimiento/suplementos adicionales incluyendo insulina y posiblemente proteínas exógenas adicionales. El medio condicionado contiene no solamente el producto secretado de interés, sino también cantidades significativas de proteínas secretadas de la célula huésped adicionales y otras sustancias (por ejemplo, ácidos nucleicos, vesículas de membrana). Aunque se expresa a elevados niveles, el producto de interés puede representar una minoría de todas las proteínas presentes en el medio condicionado. No inesperadamente, las 15 proteínas secretadas por células huésped transformadas pueden tener características bastante diferentes de las del producto de interés (por ejemplo, carga, tamaño molecular, composición de aminoácidos). Asimismo, las proteínas secretadas de la célula huésped seleccionadas pueden mostrar propiedades muy similares a las del producto de interés, colocando de este modo una carga significativa sobre el procedimiento usado para la purificación. Cuando se desarrolla un procedimiento para la purificación de una proteína recombinante a partir de medio condicionado, es 20 importante que las condiciones usadas se limiten con respecto a la desnaturalización del producto de interés (condiciones que podrían usarse para explotar diferencias minoritarias entre proteínas secretadas para un mayor beneficio para la separación), haciendo de este modo que sea difícil separar el producto de interés de todas las demás proteínas de la célula huésped presentes.

Además de las proteínas secretadas de la célula huésped descritas anteriormente, el medio condicionado 25 también puede contener productos derivados del gen expresado de forma heteróloga que codifica el producto de interés. Éstos no son deseables para la sustancia de fármaco final e incluyen, por ejemplo, formas del producto que carecen de ciertas modificaciones post-traduccionales tales como glucosilación, sulfatación, carboxilación gamma, u otra modificación potencialmente necesaria para la actividad biológica. Además, pueden estar presentes formas proteolíticamente degradadas del producto de interés en el medio condicionado que también tienen que eliminarse 30 durante la purificación, pero que se parecen mucho al producto de interés. Desafortunadamente, la mayoría de los enfoques, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, y la cromatografía por exclusión de tamaño pueden no proporcionar el grado de resolución del producto de interés necesario para su uso en situaciones terapéuticas para seres humanos a partir de estas formas no deseadas. Para aprovechar toda la ventaja de las diferencias minoritarias entre el producto deseado y los contaminantes (por 35 ejemplo, pequeñas diferencias de carga, pequeñas diferencias en el tamaño molecular) a menudo es necesario el uso de desnaturalizantes fuertes. Dichos desnaturalizantes, sin embargo, pueden conducir a una pérdida de la actividad biológica, a la expresión de sitios neoantigénicos, y potencialmente pueden potenciar la descomposición química de modificaciones post-traduccionales seleccionadas.

Además de separar el producto de interés de las moléculas con propiedades similares (por ejemplo, formas 40 modificadas del gen expresado), también es importante reconocer la necesidad de separar el producto deseado de los componentes presentes en el medio condicionado con el que interacciona específicamente. Cuando la proteína de interés está cargada positivamente, tenderá a unirse a cualquier molécula cargada negativamente presente haciendo de este modo que la purificación de la proteína por procedimientos tradicionales sea muy difícil.

Lo siguiente es de interés general antecedente a la presente invención. Yan, documento USPN 4.981.952 45 (1 de enero de 1991) y Yan, y col. Bio/Technology 8:655 (julio de 1990) que describían el uso de cromatografía de intercambio aniónico por pseudos-afinidad para la purificación de proteínas dependientes de vitamina K. Josic, y col. J. Chrom. 632:1 (1993) describía el uso de cromatografía de afinidad por heparina para resolver el factor IX de otras proteínas dependientes de vitamina K. Suomela, Thromb. Res. 7:101 (1975); Suomela, Eur. J. Bio. Chem. 71:145 (1976); y Suomela, Thrombos. Haemostis. 35:211 (1976) describían el uso de hidroxiapatita en la separación de 50 diversos factores de coagulación y variantes plasmáticos del factor IX (en base a diferencias de carga debidas a la variación en el contenido de restos de carbohidrato, por ejemplo, ácido siálico y galactosa). Sin embargo, Reekers, y

col. Haemostasis 1:2 (1972) demostraron la incapacidad de la hidroxiapatita de separar los factores II, VII y IX entre sí y de otras proteínas plasmáticas. Schwinn, y col. documento USPN 4.411.794 describían la purificación parcial de factores de coagulación de la sangre usando hidroxiapatita en presencia de calcio a una concentración de 50-200 mM. Feldman, y col. Biotech. Blood Proteins 227:63 (1993) y Roberts, y col. Vox Sang 67(supl. 1): 69 (1994) describían la reducción de la infectividad vírica usando acidificación y Sepharose quelante cargada de cobre que 5 produjo bajos rendimientos de factor IX a partir de plasma humano.

Típicamente, los investigadores han usado combinaciones de técnicas cromatográficas tradicionales para purificar productos deseados. Frecuentemente, dichas técnicas no son suficientes para la purificación de un producto al nivel de pureza y consistencia deseado para un producto terapéutico para seres humanos. Los investigadores han intentado superar esta dificultad por el uso de cromatografía de afinidad en la que una proteína 10 de interés se une a un ligando inmovilizado con el que reacciona de forma específica. Después del lavado apropiado, el producto deseado puede eluirse por alteración de la interacción ligando proteína, a menudo produciendo un eluato significativamente más puro. Sin embargo, en el caso de la separación de un producto deseado de formas modificadas presentes en el medio condicionado, las técnicas cromatográficas de afinidad de una única etapa pueden no ser suficientes, y deben usarse junto con otras resinas de afinidad y/o técnicas de 15 separación tradicionales. Incluso las etapas de cromatografía de afinidad de alta resolución (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal inmovilizado) pueden no producir suficiente resolución del producto deseado entre los otros componentes debido a los sitios comunes de interacción (por ejemplo, cuando está presente un epítope en el producto de interés, está presente también en una forma proteolíticamente degradada del producto). 20

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la técnica de procedimientos de purificación de proteínas que superen de forma eficaz dichas dificultades.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende el factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de: aplicar dichas solución a 25 una resina de hidroxiapatita, lavar dicha solución a una resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas de factor IX, eluir dicha resina de hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, donde dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato. De acuerdo con los procedimientos de la invención, el factor IX puede expresarse por células en cultivo, o producirse de forma recombinante como saben los especialistas en la técnica. Los intervalos de concentración adecuados son 30 aquellos que son eficaces para retirar los contaminantes si eluir el factor IX e incluyen, por ejemplo, sal de 25 mM a 200 mM, y preferiblemente es cloruro sódico 200 mM.

En un aspecto adicional,...

1. Un procedimiento para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de:

aplicar dicha solución a una resina de hidroxiapatita,

lavar dicha resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas del factor 5 IX,

eluir dicha resina hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, en el que dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho primer tampón fosfato es fosfato potásico 50 mM, NaCl 0,185 M, pH 7,2 y dicho segundo tampón fosfato es fosfato potásico 0,5 M, NaCl 0,2 M, pH 7,2. 10