Proteína F del VRSH en conformación pre-fusión estabilizada y anticuerpos neutralizantes específicos frente a la misma.

Proteína F del VRSH en conformación pre-fusión estabilizada y anticuerpos neutralizantes específicos frente a la misma.

La presente invención proporciona una proteína de fusión (proteína F) del virus respiratorio sincitial humano (VRSH) en conformación pre-fusión estabilizada, útil para identificar o diseñar anticuerpos y otras moléculas que se unan a ella para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de infecciones producidas por virus de la familia Paramyxoviridae, preferiblemente del género Pneumovirus, más preferiblemente por el VRSH. La presente invención se refiere también a un método de obtención de esta proteína así como a anticuerpos y a aptámeros frente a la misma, los cuales son útiles para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las infecciones mencionadas.

Proteína F del VRSH en conformación pre-fusión estabilizada y anticuerpos neutralizantes específicos frente a la misma La presente invención se encuadra en el campo de la biología molecular y la inmunología, específicamente se refiere a la proteína de fusión (proteína F) del virus respiratorio sincitial humano (VRSH) en conformación pre-fusión estabilizada y a anticuerpos frente a la misma.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El virus respiratorio sincitial humano (VRSH) es el principal agente viral causante de enfermedades severas del tracto respiratorio en la población pediátrica en todo el mundo, y es también un patógeno de considerable importancia en adultos inmunodeprimidos así como en la población anciana. Este virus pertenece al género Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae que contiene también otros virus relevantes para los humanos, tales como los responsables del sarampión, las paperas y los recientemente descubiertos virus Hendra y Nipah.

Como todos los paramyxovirus, el VRSH es un virus encapsulado cuyo genoma consiste en una molécula de RNA de cadena sencilla que codifica para 11 proteínas. Dos de estas proteínas son las principales glicoproteínas de superficie del virión, las llamadas (i) proteína de anclaje (G) , que media la unión del virus a la superficie celular, y (ii) proteína de fusión (F) , que promueve la fusión de las membranas del virus y la célula con el objeto de permitir el inicio del ciclo infeccioso, pero también interviene en la fusión de la membrana de las células infectadas con la membrana de las células vecinas para formar sincitios.

Actualmente, no existen vacunas o agentes terapéuticos específicos contra el VRSH, y aunque en los años 60 se realizó un ensayo con una vacuna basada en el virus inactivado con formalina, ésta no solo no confirió protección frente al virus sino que además se asoció con un aumento de la enfermedad en la población pediátrica tras la infección con el VRSH (Kim, H.W. et al., 1969, Am J Epidemiol, 89: 422-434) . Los anticuerpos neutralizantes juegan un papel primordial en la protección frente a las infecciones provocadas por el VRSH. Las proteínas G y F son los únicos antígenos virales capaces de inducir anticuerpos neutralizantes así como de conferir protección a relativamente largo plazo en modelos animales (Stott, E.J. et al., 1987, J Virol, 61: 3855-3861) . La transferencia pasiva de estos anticuerpos protege a los ratones y a las ratas de algodón frente al VRSH (Graham, B.S. et al., 1993, Pediatr Res, 34: 167-172; Prince, G.A. et al., 1985, Virus Res, 3: 193-206) . Además, en humanos existe una correlación positiva entre unos títulos altos de anticuerpos neutralizantes en suero y la protección de voluntarios adultos frente al VRSH (Hall, C.B. et al., 1991, J Infect. Dis, 163: 693-698) , y se ha observado una correlación inversa entre unos títulos altos de anticuerpos neutralizantes y el riesgo de infección por VRSH en niños (Glezen, W.P. et al., 1986, Am J Dis Child, 140: 543-546) y ancianos (Falsey, A.R. & Walsh, E.E., 1998, J Infect. Dis, 177: 463-466) . Estas observaciones promovieron el uso profiláctico de una preparación de inmunoglobulinas humanas (Respigam) , la cual contiene altos títulos de anticuerpos neutralizantes, para prevenir infecciones por VRSH en la población infantil de alto riesgo (Groothuis, J.R. et al., 1993, N Engl J Med, 329: 1524-1530) . Posteriormente, Respigam fue reemplazado por un anticuerpo monoclonal humanizado (Palivizumab) dirigido contra la glicoproteína F del VRSH (The IMpact-RSV Study Group, 1998, Pediatrics, 102: 531537) .

La proteína F del VRSH es una glicoproteína tipo I que se ensambla como un homotrímero. Cada monómero es sintetizado como un precursor inactivo (F0) que necesita ser cortado en dos sitios polibásicos (I y II) para convertirse en una proteína competente para la fusión (González-Reyes, L. et al., 2001, Proc. Natl Acad. Sci U.S.A, 98: 9859-9864) . El sitio II es equivalente al sitio de corte único encontrado en otras proteínas F de otros paramyxovirus. Este sitio precede a un péptido de fusión hidrofóbico que es insertado en la membrana diana durante la fusión. Se ha postulado que las proteínas F de los paramyxovirus se mantienen en una conformación pre-fusión metaestable en la partícula viral hasta que el virus se une a la membrana de la célula diana. Es entonces cuando la proteína F se activa para iniciar una serie de cambios conformacionales que permiten que la fusión ocurra en el momento y lugar adecuados. Tras la fusión, la proteína F adquiere una conformación post-fusión altamente estable determinada en gran medida por la formación de un haz de seis hélices o “six-helix-bundle” (6HB) con secuencias de dos repeticiones de un patrón de siete aminoácidos o “heptad repeat” (HRA y HRB) desde cada monómero. La energía libre emitida mientras la proteína F transita desde la estructura pre-fusión a la post-fusión dirige el proceso de fusión de membranas.

Palivizumab, así como la mayoría de los anticuerpos monoclonales frente a la proteína F del VRSH descritos, reconoce la conformación post-fusión de esta proteína, representada en una forma de proteína F no anclada, llamada FTM- (Calder, L.J. et al., 2000, Virology, 271: 122-131) . Esta proteína, modificada para eliminar la región transmembrana y la cola citoplasmática de F, es secretada al medio de cultivo y se pliega espontáneamente en la conformación post-fusión. Sin embargo, se ha visto que los anticuerpos monoclonales neutralizantes que reconocen a FTM- son también capaces de inhibir la infectividad del virus si se preincuban con el mismo antes de que éste sea usado para infectar células, es decir, antes de que la proteína F se active para la fusión. Por tanto, es probable que la mayoría de los anticuerpos monoclonales descritos hasta la fecha frente a esta proteína F reconozcan epítopos compartidos por ambas conformaciones, pre y post-fusión.

Se ha comprobado también que preparaciones de inmunoglobulinas humanas (Ig) contienen anticuerpos frente a la proteína F del VRSH (anticuerpos α-F) , los cuales pueden ser purificados por unión a FTM- covalentemente unida a cuentas de Sepharosa (Sastre, P. et al., 2005, J Med Virol, 76: 248-255) .

Por otro lado, mientras que la estructura de la proteína F del VRSH en su conformación post-fusión ha sido recientemente resuelta mediante cristalografía de rayos X (Swanson, K.A. et al., 2011, Proc. Natl Acad. Sci U.S.A, 108: 9619-9624; McLellan, J.S. et al., 2011, J Virol) , la disponibilidad de la conformación pre-fusión estabilizada es limitada debido a que la elevada inestabilidad de dicha conformación en la proteína silvestre dificulta su obtención en forma soluble. En este sentido, los intentos realizados hasta el momento para solubilizar esta forma pre-fusión no han aportado resultados satisfactorios, probablemente porque el estado metaestable de esta conformación facilita el replegamiento espontáneo en la conformación post-fusión. A pesar de ello, algunos autores han conseguido disponer de la proteína F del VRSH en su conformación pre-fusión en estado soluble, mediante la sustitución de las secuencias aminoacídicas de los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína F por una cola de 6His y mediante la modulación de la molaridad del buffer empleado para la elución durante el proceso de purificación de esta proteína modificada (Chaiwatpongsakorn, S. et al., 2011, J Virol, 85: 3968-3977) . Sin embargo, continúa siendo necesario disponer de la conformación pre-fusión de la proteína F del VRSH en una forma estabilizada que facilite el estudio, tanto de anticuerpos neutralizantes, como de otro tipo de moléculas capaces de unirse específicamente a ella y de interferir con su activación. Dicha aproximación sería interesante desde un punto de vista clínico, ya que permitiría el diseño e identificación de nuevos agentes terapéuticos útiles para el tratamiento y/o profilaxis de infecciones provocadas por el VRSH, así como por otros paramyxovirus.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una proteína de fusión (proteína F) del virus respiratorio sincitial humano (VRSH) en conformación pre-fusión estabilizada, útil para identificar o diseñar anticuerpos y otras moléculas que se unan a ella para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de infecciones producidas por virus de la familia Paramyxoviridae, preferiblemente del género Pneumovirus, más preferiblemente por el VRSH. La presente invención se refiere también a anticuerpos y a aptámeros frente a esta proteína estabilizada en la conformación pre-fusión, los cuales son útiles para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de las infecciones... [Seguir leyendo]

1. Proteína F del VRSH en conformación pre-fusión que presenta al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO: 1, que comprende:

a. al menos un puente disulfuro intermonomérico en la región que comprende los aminoácidos 450 a 550 de su secuencia aminoacídica, y

b. al menos dos aminoácidos básicos del punto de corte de furina que comprende los aminoácidos 106 a 109 de su secuencia aminoacídica y al menos cuatro aminoácidos básicos del punto de corte de furina que comprende los aminoácidos 131 a 136 de su secuencia aminoacídica, sustituidos por asparagina o por glutamina.

2. Proteína según la reivindicación 1 que comprende dos puentes disulfuro intermonoméricos formados mediante la sustitución de los aminoácidos Leu481, Asp489, Ser509 y Asp510 por cisteínas.

3. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende los aminoácidos básicos Arg106, Arg108, Arg109, Lys131, Lys132, Arg133, Lys134, Arg135 y Arg136 sustituidos por asparagina.

4. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que además comprende una cola de histidinas en el extremo C-terminal.

5. Proteína según la reivindicación 4 donde la cola de histidinas se ha formado mediante la adición de la SEQ ID NO: 2 en el extremo C-terminal de la proteína.

6. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

7. Secuencia nucleotídica aislada que codifica para la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Anticuerpo frente a la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Aptámero frente a la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Método de obtención de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende:

a. sustituir, en una secuencia aminoacídica de la proteína F del VRSH que presenta al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO: 1, al menos dos aminoácidos básicos del punto de corte de furina que comprende los aminoácidos 106 a 109 y al menos cuatro aminoácidos básicos del punto de corte de furina que comprende los aminoácidos 131 a 136, por asparagina o por glutamina,

b. introducir al menos un puente disulfuro intermonomérico en la región que comprende los aminoácidos 450 a 550 de la secuencia aminoacídica de la proteína F del VRSH del paso (a) ,

c. expresar la proteína F del VRSH modificada en los pasos (a) y (b) en un sistema de expresión, y

d. purificar la proteína expresada en el paso (c) .

11. Método según la reivindicación 10, donde los aminoácidos básicos del paso (a) son Arg106, Arg108, Arg109, Lys131, Lys132, Arg133, Lys134, Arg135 y Arg136 y se sustituyen por asparagina.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde en el paso (b) se introducen dos puentes disulfuro intermonoméricos mediante la sustitución de los aminoácidos Leu481, Asp489, Ser509 y Asp510 de la secuencia aminoacídica de la proteína F del VRSH del paso (a) por cisteínas.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que además comprende añadir una cola de histidinas en el extremo C-terminal de la secuencia aminoacídica de la proteína F del VRSH del paso (b) .

14. Método según la reivindicación 13, donde la cola de histidinas se añade mediante la adición de la SEQ ID NO: 2 en el extremo C-terminal de la secuencia aminoacídica de la proteína F del VRSH del paso (b) .

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 donde el sistema de expresión del paso (c) es el virus vaccinia.

16. Uso de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la identificación o diseño de compuestos o composiciones para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de infecciones producidas por virus pertenecientes al género Pneumovirus.

17. Uso de la proteína según la reivindicación 16 donde el virus es el VRSH.

18. Uso de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento.

19. Uso de la proteína según la reivindicación 18 para la elaboración de un medicamento para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de infecciones producidas por virus pertenecientes al género Pneumovirus.

20. Uso de la proteína según la reivindicación 19 donde el virus es el VRSH.

21. Uso de la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el medicamento es una vacuna.

22. Uso del anticuerpo según la reivindicación 8 o del aptámero según la reivindicación 9 para la detección de la proteína F de virus pertenecientes al género Pneumovirus.

23. Uso del anticuerpo o del aptámero según la reivindicación 22 donde el virus es el VRSH.

24. Uso del anticuerpo según la reivindicación 8 o del aptámero según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento.

25. Uso del anticuerpo o del aptámero según la reivindicación 24 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infecciones producidas por virus pertenecientes al género Pneumovirus.

26. Uso del anticuerpo o del aptámero según la reivindicación 25 donde el virus es el VRSH.

pre-inmune FIG. 1

VRSH Control VRSH

VRSH

Control

Control

Vac/P Vac/P

Control Vac/P

Control

Vac/Fc

Vac/Fc

Control

Vac/Fc

Vac/P Vac/P Control

Vac/P Vac/Fc

Control Vac/Fc Control

Vac/Fc

Vac/P Vac/P

Vac/P

Vac/Fc

Vac/Fc

Control

Control

Vac/Fc

Control

FIG. 2

FIG. 3

kDa 100 75

d

Ftrímero Fdímero

F0

FcNFcN/2C-C FTM-

FcNFcN/2C-CFTM-

FIG. 4

FIG. 4 (cont.) FIG. 5

FIG. 5 (cont.)