La presente invención se refiere a la detección e identificaciónde diferentes especies bacterianas,

todas ellas causantes de zooosis, basada en el análisis de ADN. Más concretamente, la invencón proporciona los cebadores, las sondas, los genes y las regions génicas para llevar a cabo un método para la detección simultáea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los género Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsi y Francisella mediante PCR Múltiple y análisis por RLB (ReverseLine Blotting), además de proporcionar el kit para llevarlo a cao

Metodo y kit de deteccion de especies bacterianas mediante analisis de ADN

La presente invenciOn se refiere a la detecciOn e identificaciOn de diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zoonosis, basada en el analisis de ADN. Mas concretamente, la invencion proporciona un metodo y un kit para la deteccion simultanea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, RickettsiayFrancisellabasados en la amplificaciOn de ADN.

10 ANTECEDENTES

Actualmente hay descritas unas 200 enfermedades zoonoticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme .. .) que el hombre puede padecer. En los 'Daises del tercer mundo, representan una de las principales causas de mortalidad y suponen cuantiosas perdidas economicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras

sanitarias y el bajo nivel cultural continUan siendo los principales aliados de estas enfermedades.

Determinados tipos de zoonosis tienden a extenderse por parses desarrollados como consecuencia del aumento de la poblacion en zonas urbanas y periurbanas, asi como del aumento del trafico de animales a nivel internacional, que conlleva el riesgo de introducir enfermedades exOticas en nuestro entorno.

Estas circunstancias unidas a los frecuentes hallazgos de artropodos infectados por mas de uno de los patogenos incluidos en la presente invencion, aumenta la posibilidad de transmisiOn de mas de una de las especies bacterianas incluidas en la presente invencion por la misma picadura.

Asi pues, cada vez son mas comunes las hospitalizaciones debidas a cuadros clInicos producidos por el contacto del hombre con animales o con diferentes clases de artropodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, acaros, etc., los cuales actuan como vectores o como reservorios de patOgenos. Dichos cuadros clInicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificacion rapida y fiable del agente causante de la patologia, por lo que no es posible un tratamiento especifico y rapido, y en ocasiones Ilega demasiado tarde. Esto justifica, sin dejar lugar a

dudas, la necesidad de un metodo integrado de detecciOn.

Los metodos diagnosticos disponibles actualmente se limitan a la deteccion de anticuerpos que, por lo general, es retrospectiva y de escasa ayuda en el tratamiento de los pacientes en su fase aguda. El cultivo no es considerado un metodo diagnostic°, tanto por su dificultad tecnologica, que lo excluye de las practicas habituales en un laboratorio

de microbiologia de hospital, como por la necesidad de instalaciones P3.

El diagnostic° molecular por amplificacion de genoma mediante PCR supone una opcion diagnostica de gran valor. Sin embargo, no siempre se dispone de suficiente cantidad de muestra clInica como para ensayarla frente a una amplia bateria de patogenos o no se dispone de la metodologia necesaria para realizar diferentes ensayos.

Recientemente se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. y col. 2005. Oligo-based detection of tick-borne bacteria. FEMS Microbiology Letters 243: 473 — 478) , que describe un metodo para la detecciOn de productos de PCR ribosomal 16S de bacterias de picadura por garrapata incluyendo Barrelia spp., Rickettsiaspp., Anaplasma spp., Coxiellaspp. yFrancisellaspp.Dicho metodo esta basado en el analisis de ADN ribosomal y emplea cebadores

45 universales, que amplifican el material genetic° tanto de bacterias diana como de otras que no los son por lo que su sensibilidad es bastante reducida.

Otros metodos, tal como el descrito por las patentes Americanas US 6.300.072 y 6.518.020, son capaces de detectar e identificar bacterias del *ler° Bartonella, usando la misma region de ADN (espacio intergenico 16S —

50 23S) . Sin embargo, el numero de especies dentro de este genero ha aumentado sensiblemente ya que dichas patentes se registraron y su aproximacion, que consiste en una discriminacion entre especies segun el tamario del amplicon obtenido en una PCR, no es al para determinadas especies del mismo genero que tienen un tamario similar al fragmento amplificado. Tambien se conoce en el estado de la tecnica un ensayo de hibridaciOn por PCR de deteccion sensible y especifica para la detecciOn e identificaciOn simultanea de EhrlichiayBarreliaburgdarferien

55 sentido amplio (SchouIs y col., 1999. Detection and Identification of Ehrlichia, Borrelia burgdorferi Sensu Lato, and Bartonella Species in Dutch Ixodes ricinus Ticks, Journal of Clinical Microbiology, 37: 2215 — 2222) .

El metodo aportado por la presente invenciOn propone tambien el empleo de la region intergenica 16S— 238 para la deteccion de especies pertenecientes al genero Bartonella, se han introducido mejoras con respecto a los metodos

que se han descrito previamente, puesto que es capaz de detectar un grupo mucho mas amplio de especies del mismo y otros generos, usando sondas y cebadores completamente novedosos y con niveles de sensibilidad maximos.

Para la detecciOn de Coxiella bumetii, la presente invenciOn emplea los mismos cebadores y la misma region de ADN (secuencia de insercion IS1111) que los metodos que se han descrito previamente. Dicha deteccion se ha mejorado combinandola con otra serie de pruebas completamente novedosas para la identificacion de otras especies bacterianas, que pueden ser transmitidas por los mismos vectores, y ademas aporta una nueva sonda de hibridacion para la deteccion de Coxiellaburnetii.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Definiciones: PCR multiple o PCR Multiplex: PCR (ReacciOn en cadena de la polimerasa) es un sistema mediante el cual se amplifica o aumenta un numero de copias de una secuencia nucleoticlica especifica usando dos cebadores. 15 El analisis por PCR mOltiple o PCR Mutiplex es una variante del analisis por PCR que permite la amplificacion simultanea de mas de una secuencia diana usando mas de un par de cebadores.

La presente invencion resuelve el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado numero de bacterias, que causan zoonosis que pueden ser clinica y/o epidemiolOgicamente indistinguibles, mediante el

desarrollo de un metodo y un Kit de detecciOn para la identificaciOn simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los generos: Anaplasma, Ehrlichia, Barrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella.

La solucion encontrada por la presente invencion consiste en analizar diferentes regiones del ADN bacteriano

simultaneamente para determinar en cada caso que especies se encuentran presentes. En concreto, se analiza el gen 16S ARNr para detectar la presencia de Anaplasma, EhrilchiayBarrelia;el espacio intergenico 23S — 5S ARNr para detectar la presencia de Rickettsia; el gen que codifica para el precursorde laproteina principaldemembrana TUL4 para detectar la presencia de Francisella; el gen de la transposasa IS1111 para detectar la presencia de Coxiellay el espacio intergenico 16S — 23S para detectar la presencia de Bartonella.

De acuerdo con lo anterior, un primer aspecto de la invencion se ref iere a un metodo para la deteccion de bacterias a partir de una muestra, que comprende los siguientes pasos:

i) Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reaccion, que contiene cebadores especificos para la 35 realizaciOn de PCR Multiplex.

ii) La amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa.

iii) La identificacion de formacion de los productos del paso anterior, siendo dicha formacion indicativa de la 40 presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.

Los cebadores especificos que se han mencionado en la etapa (i) son SEO ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37.

45 En relaciOn con este primer aspecto de la invenciOn, dicha invencion proporciona un metodo para detectar simultaneamente:

•Anaplasmaphagocytophilum, A.bovis, A.equi, A.marginate, A.centraleyA.ovis.

50 • EhrlichiachaffeensisyE.Ewingii.

•Bartonellahenselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B.grahamii, B. vinsoniisubespecieberkhofii, B. vinsanii subespecievinsonii, B. vnisoniisubespecieaurupensis, B.bacilliformis,... [Seguir leyendo]

1. Metodode analisis para la deteccion simultanea de especies bacterianas, que pertenecen a los

generos Anaplasma, Ehrrichia, BegoneIla, Barrelia, Coxiella, FrancisellayRickettsia, que comprende: 5

a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reaccion, que contiene cebadores especificos de SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para realizar PCR

b. Amplificar mediante reaccion en cadena de la polimerasa. 10

c. Identificar la formacion de productos del paso anterior, siendo dicha formacion indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.

2. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que las especies bacterianas detectadas son: 15

a. Anaplasmaphagocytophilum, A.bovis, A.equi, A.marginale, A.centrateyA.ovis.

b. EhrlichiachaffeensisyE.Ewingii.

c. Barton&lahenselae, B.quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B.grahamii, B. vinsonii subespecieberkhafii, B. vinsonii subespecievinsonii, B. vnisoniisubespecieaurupensis, B.bacilliformis, B. alsatica, B.bovis, B.dash/ac, B. koehlerae, B.schaenbuchensis, B. taylariyB. tribocarum.

d. Todas las especies del genero Barrelia. 25

e. Coxiellaburnetii.

f. Cualquier subespecie de Francisellatularensis, incluyendo F. tularensissubesp. tularensis, F. tularensissubesp.

holarctica yF. tularensissubesp. novicida, que se detectan conjuntamente, y la variante 3523 de la misma especie y 30 los denominados endosimbiontes de diferentes especies de ixOdidos y argasidos, que se detectan diferencialmente.

g. El genero Rickettsia, el grupo de las mismas causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tif us, las especies Rickettsiaakari, R.belifi, R.slovaca, R.conarii, R.aeschfimannii, R. ricketsii, R.sibirica, R.helvetica, R. fe s, R.australis, R.prowazekii, yR. typhy (R.mooserh) .

3. Elmetodo, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detecciOn simultanea de los productos de amplificacion se realiza usando sondas que comprenden las secuencias SEQ ID NO: 3 — 6, 9 — 24, 27, 30, 33 — 35 y 38 — 51.

4. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos un control interno de amplificacion.

5. Metodo, segun la reivindicacion 4, en el que el control interno de amplificacion consiste en:

45 a. La amplificaciOn de la SEQ ID NO: 94 con cebadores especificos.

b. La detecciOn de la formaciOn del producto de amplificacion resultante de la etapa anterior.

6. Metodo, segun la reivindicacion 5, en el que los cebadores especificos tienen las secuencias SEQ ID 50 NO: 52 y SEQ ID NO: 53.

7. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones 4 — 6, en el que la deteccion del producto de amplificacion se realiza usando la sonda con la SEQ ID NO: 54.

55 8. Usoin vitro de los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para la amplificacion simultanea de ADN de especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, BegoneIta, Barrel/a, Coxiella, Francisella yRickettsia.

9. Eluso de los cebadores, segun la reivindicacian 8, que comprende adicionalmente los cebadores de la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 53 para el control interno de amplificaciOn.

10. Uso invitrode las sondas de las SEQ ID NO: 3 — 6, 9 — 24, 27, 30, 33 — 35 y 38 — 51, para la

detección simultanea de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Barrelia, Coxiella, FrancisellayRickettsia, en el que dichas sondas son capaces de hibridar con los fragmentos correspondientes de las SEQ ID NO: 55— 93.

11. Usode las sondas, segun la reivindicacion 10, que comprende adicionalmente la sonda con la SEQ ID 10 NO: 54 capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.

12. Usoin vitro de un kit, en el que dicho kit comprende los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para la amplificacion simultanea de ADN de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, FrancisellayRickettsia.

13. El uso de un kit, segun la reivindicacion 12, que comprende adicionalmente los cebadores de las SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53 para el control interno de amplificación.

14. Usoin vitro de un kit, en el que dicho kit comprende las sondas de las SEQ ID NO: 3— 6, 9 —24, 27,

30, 33 — 35 y 38 — 51, para la detecciOn simultanea de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Francisella y Rickettsia, en el que dichas sondas son capaces de hibridar con los fragmentos correspondientes de ADN de las SEQ ID NO: 55 — 93.

15. Usodel kit, segun la reivindicacian 14, que comprende adicionalmente la sonda con la SEQ ID NO: 54 25 capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.