Método de amplificación genómica del virus West Nile. El método se basa en la amplificación de una zona de la región 3' no codificante del virus,

preferiblemente mediante PCR en Tiempo Real, gracias al uso de una pareja de cebadores mínimamente degenerados, lo que permite la amplificación de virus West Nile presentes en una muestra de cualquiera de los linajes conocidos. El fragmento amplificado se detecta, preferiblemente, con una sonda específica de la zona, también mínimamente degenerada. La pareja de cebadores degenerados elegidos, así como la sonda preferida, dan lugar a una alta sensibilidad en la detección de todos los linajes y también a una alta especificidad para el virus West Nile.

Método de amplificación genómica del virus West Nile.

Campo técnico

La invención se refiere al campo de la Biotecnología. Más concretamente, la invención se refiere a un método que permite la amplificación genómica en Tiempo Real de cualquiera de los linajes del virus West Nile presentes en una muestra y que, por tanto, facilita la detección de la presencia del virus en una muestra.

Antecedentes de la invención

El virus West Nile (WNV) es un virus RNA de polaridad positiva perteneciente al género Flavivirus. Este género comprende numerosos virus patógenos para el ser humano e incluso potencialmente letales, tales como el virus del Dengue, el de la fiebre amarilla o los virus pertenecientes al serogrupo del virus de la encefalitis japonesa, un serogrupo al cual pertenece tanto el virus West Nile como otros virus estrechamente relacionados con él como el propio virus de la encefalitis japonesa (JEV) , el virus de la encefalitis de San Luis (SLEV) , el virus de la encefalitis de Murray Valley (MVEV) o el virus Usutu (USUV) .

Dentro de dicho subgrupo, se conoce como “virus West Nile” (WNV) a un complejo que comprende diferentes linajes evolutivos. Una revisión de la bibliografía lleva a la conclusión de que existen al menos cinco linajes diferentes, varios de ellos con virulencia desconocida, y con una diferencia en nucleótidos del 20% entre cada uno de ellos (Bondre et al., J Gen Virol 88: 875-884 (2007) ) . Recientes hallazgos, además, sugieren la existencia de más linajes evolutivos: el análisis de la secuencia de un virus cultivado a partir de un mosquito capturado en Malasia, cedido por el Instituto Pasteur al grupo de los inventores, que llevaron a cabo la secuenciación completa del genoma de dicho virus en 2006, permitió la identificación de un sexto linaje evolutivo; más recientemente, en la propia Europa, concretamente en España, pudo detectarse una cepa del virus West Nile que, aunque no pudo ser cultivada, ha sido secuenciada parcialmente, dando resultados que llevan a la conclusión de que se trata de un séptimo linaje evolutivo del virus (datos divulgados en la tesis doctoral de la Dra. Ana Vázquez González, de título “Búsqueda de flavivirus en mosquitos de humedales españoles. Análisis molecular del virus West Nile y otros flavivirus”, leída en Diciembre del 2008) .

El virus West Nile se mantiene en la naturaleza en un ciclo natural que implica principalmente a aves y a mosquitos, aunque los humanos y los equinos pueden ser infectados también, pudiendo dar lugar en ellos a una enfermedadneurológica mortal. El origen del virus es africano, y tiene una distribución a nivel mundial (África, Asia, Europa, Oriente Medio, India, Australia y América) . Desde que se aisló por primera vez, los brotes en humanos han sido poco frecuentes, pero en las últimas décadas ha cobrado gran importancia debido a su emergencia a zonas nuevas, como ha sido su entrada y expansión por el continente americano y por las recientes epidemias que ha producido en Europa, asociadas a altos niveles de enfermedad neuroinvasiva y mortalidad. Hasta el año 1999, WNV se distribuía exclusivamente en el Viejo Mundo, pero en ese año se detectó por primera vez en el continente Americano en la ciudad de Nueva York, y a partir de ahí el virus ha sido capaz de extenderse por todo Norteamérica, sur de Canadá, Centroamérica, islas del Caribe y Sudamérica.

Muchos seres humanos infectados no presentan síntomas clínicos aparentes, aunque pueden acabar desarrollando enfermedades neurológicas graves tales como meningitis o encefalitis. Es más habitual el desarrollo de síntomas más moderados, tales como fiebre, malestar, anorexia, náuseas, vómitos, dolor de cabeza, molestias oculares, mialgia, erupciones cutáneas y linfoadenopatía. Sin embargo, en los últimos tiempos parecen estar apareciendo variantes más virulentas, que están convirtiendo al virus en un serio problema para la salud pública y que hacen aconsejable un diagnóstico precoz del mismo, para evitar el desarrollo de enfermedades neurológicas.

El gran brote epidémico que está afectando a América ha llevado a incrementar el interés por el conocimiento del virus, sus vías de transmisión y los medios para su detección. Así, se ha descubierto que, además de la picadura de los mosquitos, la transmisión puede producirse también por otras vías tales como la donación de sangre, el trasplante de órganos y la alimentación con leche materna. Esto ha llevado a las autoridades de EE.UU. a estudiar en todas las donaciones la posible presencia del genoma de WNV. En Europa, donde parecer circular cepas pertenecientes al menos a los linajes 1, 2, 3, 4 y 7, los recientes brotes que han afectado a prácticamente todos los países mediterráneos han llevado a la Unión Europea a debatir los procedimientos de control de infección en trasplantes y donaciones en los países de su área de influencia y a considerar la obligatoriedad del análisis de la posible presencia de WNV en donaciones efectuadas en regiones endémicas europeas.

Dado que no es sencillo intuir la presencia del virus en un individuo, pues muchos portadores del WNV son asintomáticos e incluso, cuando se produce una infección activa, la misma suele dar lugar a síntomas inespecíficos, está adquiriendo una creciente importancia la comprobación sistemática de la posible presencia del virus en muestras de sangre y órganos susceptibles de ser trasplantados. Como, normalmente, los anticuerpos específicos contra el virus pueden ser detectados sólo después de la fase virémica e incluso, pueden persistir durante más de un año, haciendo difícil distinguir entre la situación de infección activa y los efectos de exposiciones acontecidas en el pasado, se está incrementando el interés en el desarrollo de métodos más sensibles para la detección del virus. Por ello, se han descrito numerosos ensayos que describen métodos de amplificación genómica para la detección de los ácidos nucleicos de dicho virus.

Por desgracia, la mayor parte de ellos toman como diana el WNV que circula actualmente en Norteamérica, centrándose en la detección de virus del linaje 1, sin considerar la enorme variabilidad natural existente en otros lugares del mundo, con lo que se encuentran muy pocos métodos que consideren la necesidad de detectar al menos un segundo linaje viral. Es más, la comparación de las secuencias de los cebadores utilizados demuestra que, incluso en los métodos desarrollados para cepas del linaje 1, hay cepas pertenecientes a dicho linaje que no podrían ser detectadas mediante el método propuesto.

Así, por ejemplo, Lanciotti et al. (en J. Clin. Microbiol. 38:4066-4071 (2001) ) desarrollaron un ensayo de PCR en Tiempo Real basado en sondas TaqMan para la detección del RNA del WNV en diversas muestras (tanto de origen humano como obtenidas de aves o mosquitos) que se basó en la cepa NY99, consiguiendo resultados aceptables para esta cepa, especialmente con los cebadores desarrollados para la zona de 3’ No Codificante (3’NC) , pero el método no es válido para muchas otras cepas de recientes brotes del linaje 1 ni para los demás linajes. Trabajos posteriores del mismo grupo (Lanciotti and Kerst, J Clin Microbiol. 39:4506-4513 (2001) ) , consiguieron mejorar la sensibilidad adaptando la metodología a la detección con NASBA, aunque los problemas de falta de capacidad de detección de todos los linajes subsisten. El mismo problema existe con los métodos que han intentado mejorar el método de Lanciotti mejorando el modo de cuantificación (Lo et al., J Virol 77: 10004-10014 (2003) ) o las muestras de partida (Vanlandingham et al., Am J Trop Med Hyg 71:120-123 (2004) ) .

Por otra parte, muchos de los métodos desarrollados no son totalmente específicos para WNV, sino que detectan igualmente la presencia de otros virus del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. Tal es el caso, por ejemplo, del método de RT-PCR desarrollado por Shirato et al. (Shirato et al., J Virol. Methods 126:119-125 (2005) ) , donde se describe el uso de cebadores específicos diseñados en la zona de la proteína C que permiten amplificar los linajes I y II del WNV y los cinco genotipos del virus de la encefalitis japonesa. Este método, como otros varios de similares características, incluye una sonda, marcada con un fluorocromo, complementaria a secuencias del genoma del WNV y el JEV, que permite la detección de ambos virus.

Una mejora más que se ha introducido en estas técnica de detección de ácidos nucleicos de WNV es la incorporación... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección del virus West Nile presente en una muestra que comprende las etapas de: a) amplificar los ácidos nucleicos del virus West Nile presentes en dicha muestra utilizando como cebadores los

en donde la detección del ácido nucleico amplificado indica la presencia del virus West Nile en dicha muestra.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la detección del ácido nucleico amplificado se realiza utilizando como sonda la secuencia representada por SEQ ID NO:3.

3. Método según la reivindicación1ó2, enelque la etapa a) de amplificación de los ácidos nucleicos del virus West Nile presentes en la muestra comprende las siguientes subetapas:

i) síntesis del cDNA a partir del RNA del virus West Nile presente en la muestra mediante una transcriptasa inversa;

ii) amplificación del cDNA mediante PCR en Tiempo Real utilizando como cebadores los oligonucleótidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2; y

la etapa b) de detección del fragmento de ácido nucleico amplificado se lleva a cabo mediante el uso de una sonda fluorogénica que consiste en un oligonucleótido monocatenario, complementario al fragmento de ácido nucleico amplificado en la reacción de PCR, covalentemente unido a al menos un compuesto fluorocromo.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda está covalentemente unido en 5’ a un primer compuesto fluorocromo y en 3’ a un segundo compuesto fluorocromo quencher capaz de aceptar la energía emitida por el primer fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3 y de disiparla en forma de fluorescencia de mayor longitud de onda que la emitida por el primer fluorocromo.

6. Método según la reivindicación 4, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda está covalentemente unido en 5’ a un compuesto fluorocromo y en 3’ a un compuesto quencher no fluorescente, capaz de aceptar la energía emitida por el compuesto fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3 y que contiene un resto MGB capaz de unirse al surco menor del DNA.

7. Método según la reivindicación 6, en el que compuesto fluorocromo unido en 5’ es 6-carboxifluoresceína (FAM) .

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la amplificación de los ácidos nucleicos del Virus West Nile se lleva a cabo en presencia de una molécula de DNA útil como control interno que comprende un fragmento que puede ser amplificado mediante PCR con los cebadores de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 por comprender secuencias complementarias a ambos cebadores, situadas de manera que cada cadena de la molécula de DNA contiene la secuencia de uno de dichos cebadores y la secuencia complementaria al otro cebador, estando dichas secuencias correspondientes a los cebadores separadas por un fragmento heterólogo, exógeno tanto con respecto al genoma del virus West Nile como al genoma de la especie de la que se ha extraído la muestra en la que se desea comprobar la presencia del virus West Nile.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la molécula de DNA útil como control interno comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:6.

10. Método según la reivindicación 9, en el que se detecta la amplificación del DNA útil como control interno mediante el uso de una sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7 lleva covalentemente unido un compuesto fluorocromo distinto de cualquier fluorocromo presente en la sonda de SEQ ID NO:3.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el compuesto fluorocromo es NED.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende una etapa previa en la que se lleva a cabo una reacción de amplificación por PCR de los oligonucleótidos de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, que sirven tanto como cebadores como moldes, dando lugar a un producto de amplificación que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los ácidos nucleicos amplificados en la etapa a) del método han sido extraídos de una muestra biológica.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la muestra biológica ha sido tomada de un ser humano.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la muestra biológica se selecciona de líquido cefalorraquídeo, muestras de órganos, muestras de sangre o suero obtenido de la misma.

17. Método según la reivindicación 14, en el que la muestra biológica procede de un artrópodo o de un ave.

18. Un kit que comprende los oligonucleótidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

19. Kit según la reivindicación 18, que adicionalmente comprende una sonda que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

20. Kit según la reivindicación 19, en el que la sonda de SEQ ID NO:3 presenta unido al extremo 5’ un compuesto fluorocromo y en 3’ un compuesto quencher no fluorescente, capaz de aceptar la energía emitida por el compuesto fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3, compuesto quencher no fluorescente que contiene un resto MGB capaz de unirse al surco menor del DNA.

21. Kit según la reivindicación 20, que adicionalmente contiene una sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7.

22. Kit según la reivindicación 21, en el que la sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8 lleva unido covalentemente un compuesto fluorocromo distinto de cualquier fluorocromo presente en la sonda de SEQ ID NO:3.

23. Kit según la reivindicación 21 ó 22, que adicionalmente comprende los oligonucleótidos de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5.

24. Kit según la reivindicación 21 ó 22, que adicionalmente comprende una molécula de DNA que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:6.

25. Kit según la reivindicación 24, en el que la molécula de DNA es un plásmido.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Instituto de Salud Carlos III

<120> MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA DEL VIRUS WEST NILE

<130> P-100851

<160> 57

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo WNVRT_F para la amplificación de un fragmento de región no codificante de 3’ del virus West Nile

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso WNVRT_Re para la amplificación de un fragmento de región no codificante de 3’ del virus West Nile

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda de la invención para la detección del virus West Nile amplificado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> /nota: Fluoróforo, preferiblemente FAM, unido en 5’

<220>

<221> misc_feature

<222> (15) .. (15)

<223> /nota: MGB unido a 3’ en realización preferida

<400> 3

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido para la amplificación del control interno que contiene el cebador directo de PCR en Tiempo Real

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (23)

<223> Secuencia del cebador directo de PCR

<400> 4

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido para la amplificación del control interno que contiene el cebador inverso de PCR en Tiempo Real

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (21)

<223> Secuencia del cebador inverso de PCR

<400> 5

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia del control interno de amplificación y/o extracción

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (23)

<223> Secuencia del oligonucleótido WNRT_F (SEQ ID NO:1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (44) .. (64)

<223> Secuencia complementaria al oligonucleótido WNRT_Re (SEQ ID NO:2)

<220>

<221> misc_feature

<222> (44) .. (64)

<223> Secuencia complementaria al oligonucleótido WNVRT_Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda del control interno

<400> 7

<210> 8

<211> 93

<212> DNA

<213> West Nile Virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (93)

<223> Fragmento de la región 3’ no codificante del virus West Nile (nucleótidos 10530 a 10622 del aislado Eg101)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (23)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (35) .. (49)

<223> Fragmento de unión de la sonda de SEQ ID NO:3

<220>

<221> misc_feature

<222> (73) .. (93)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 8 <210> 9

<211> 93

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (93)

<223> Fragmento de la región 3’ no codificante del virus West Nile, aislado MP502_66, amplificado por el método de la invención

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (23)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (35) .. (49)

<223> Fragmento de unión de la sonda de SEQ ID NO:3

<220>

<221> misc_feature

<222> (73) .. (93)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 9

<210> 10

<211> 93

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (93)

<223> Fragmento de la región 3’ no codificante del virus West Nile, aislado HU2925_06_3nc, amplificado por el método de la invención

<220>

<221> source

<222> (1) .. (93)

<223> Fragmento de la región 3’ no codificante del virus West Nile, aislado HU2925_06, amplificado por el método de la invención

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (23)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (35) .. (49)

<223> Fragmento de unión de la sonda de SEQ ID NO:3

<220>

<221> misc_feature

<222> (73) .. (93)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 10

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (31)

<223> Virus West Nile: Secuencia en la que están contenidas las secuencias de todos los cebadores de amplificación del WNV de la Tabla 5 de la solicitud WO 2004/036190

<400> 11

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (70)

<223> Virus West Nile: Secuencia en la que están contenidas las secuencias de todos los cebadores de amplificación del WNV de la Tabla 6 del documento WO 2004/036190

<400> 12

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (48)

<223> Virus West Nile: porción de SEQ ID NO:12 preferida para el diseño de cebadores de amplificación del WNV según la solicitud WO 2004/036190

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (24)

<223> Virus West Nile: porción de SEQ ID NO:12 preferida para el diseño de cebadores de amplificación del WNV según la solicitud WO 2004/036190

<400> 14

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 15

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<220>

<221> modified_base

<222> (1) .. (1)

<223> I: inosina

<220>

<221> modified_base

<222> (1) .. (1)

<223> I: inosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> nesa, c, g, ot

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<220>

<221> modified_base

<222> (1) .. (1)

<223> I. inosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> nesa, c, g, ot

<400> 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 24

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 26

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 27

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 28

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 29

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 30

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<220>

<221> modified_base

<222> (7) .. (7)

<223> I: inosina

<220>

<221> modified_base

<222> (10) .. (10)

<223> I: inosina

<220>

<221> misc_feature

<222> (10) .. (10)

<223> nesa, c, g, ot

<400> 34

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR de la región 3’ no codificante del virus West Nile

<220>

<221> modified_base

<222> (10) .. (10)

<223> I

<220>

<221> misc_feature

<222> (10) .. (10)

<223> nesa, c, g, ot

<400> 35

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 37

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 38

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 39

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 40

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 41

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 42

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> RNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 44

<210> 45

<211> 19

<212> RNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 45 <210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 46

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 47

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sonda propuesta en la solicitud WO 2004/036190 para la detección de virus West Nile amplificado

<400> 48

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR para la amplificación del virus West Nile

<400> 49

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR para la amplificación del virus West Nile

<400> 50

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR para la amplificación del virus West Nile: propuesta inicial, cebador WNVRT-R1

<400> 51

<210> 52

<211> 61

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4WNQF: cebador directo de PCR en Tiempo Real para la amplificación de fragmento de la región 3’ NC del aislado LEIV-Krnd88-190 del virus West Nile

<220>

<221> source

<222> (1) .. (61)

<223> Aislado LEIV-Krnd88-190 del virus West Nile (GenBank: AY277251) , nucleótidos 10470-10530

<220>

<221> misc_feature

<222> (9) .. (31)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<400> 52

<210> 53

<211> 67

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4WNQRe: cebador inverso de PCR en Tiempo Real para la amplificación de fragmento de la región 3’ NC del aislado LEIV-Krnd88-190 del virus West Nile

<220>

<221> source

<222> (1) .. (67)

<223> Aislado LEIV-Krnd88-190 del virus West Nile (GenBank: AY277251) , nucleótidos 10512-10578

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (21)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 53

<210> 54

<211> 61

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 5WNQF: cebador directo de PCR en Tiempo Real para la amplificación de fragmento de la región 3’ NC de la cepa 804994 del virus West Nile

<220>

<221> source

<222> (1) .. (61)

<223> Cepa 804994 del virus West Nile (GenBank: DQ256376) , nucleótidos 10509-10570

<220>

<221> misc_feature

<222> (9) .. (31)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<400> 54

<210> 55

<211> 69

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 5WNQRe: cebador inverso de PCR en Tiempo Real para la amplificación de fragmento de la región 3’ NC de la cepa 804994 del virus West Nile

<220>

<221> source

<222> (1) .. (69)

<223> Cepa 804994 del virus West Nile (GenBank: DQ256376) , nucleótidos 10551-10619

<220>

<221> misc_feature

<222> (2) .. (20)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 55

<210> 56

<211> 11029

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (11029)

<223> Aislado Eg101 del virus West Nile, secuencia completa (número de acceso en GenBank AF260968)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10530) .. (10552)

<223> Fragmento correspondiente al cebador directo WNRT-F (SEQ ID NO:1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10530) .. (10622)

<223> Fragmento amplificado por el método de la invención

<220>

<221> misc_feature

<222> (10602) .. (10622)

<223> Fragmento correspondiente al cebador inverso WNRT-Re (SEQ ID NO: 2)

<400> 56

ES 2 364 833 A1

ES 2 364 833 A1

ES 2 364 833 A1

ES 2 364 833 A1

ES 2 364 833 A1

<210> 57

<211> 571

<212> DNA

<213> West Nile virus

<220>

<221> source

<222> (1) .. (571)

<223> Aislado MP502-66 del virus West Nile, región 3’NC

<400> 57