Cebadores, sondas y kits para la detección de especies bacterianas que pertenecen al género Bartonella.

Un par de cebadores que tienen un cebador que consiste en la SEQ ID NO:

7 y un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 8, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 61-76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Bartonella.

Cebadores, sondas y kits para la detección de especies bacterianas que pertenecen al género Bartonella

La presente invención se refiere a la detección e identificación de especies bacterianas que provocan zoonosis, basada en el análisis de ADN. Más específicamente, la invención proporciona cebadores y kits para la detección de bacterias pertenecientes al género Bartonella basados en la amplificación de ADN.

Antecedentes

Hasta la fecha hay descritas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que afectan a seres humanos. En los países en vías de desarrollo, son una de las principales causas de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.

Determinados tipos de zoonosis se están difundiendo ahora en países industrializados como consecuencia del aumento de la población en zonas urbanas y periurbanas, así como del aumento del tráfico de animales a nivel internacional, que conlleva el riesgo de introducir enfermedades exóticas en nuestro entorno.

Estas circunstancias, unidas al hallazgo frecuente de artrópodos infectados por más de uno de los patógenos incluidos en la presente invención, aumentan la posibilidad de que se transmita más de una de las especies bacterianas incluidas en la presente invención en una única picadura.

Como resultado, cada vez son más comunes las hospitalizaciones debidas a cuadros clínicos producidos por el contacto de seres humanos con animales o con diferentes clases de artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, etc., que actúan como vectores o como reservónos de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente patógeno, por lo que no es posible un tratamiento específico y rápido, y en ocasiones se administra demasiado tarde. Esto justifica, sin dejar lugar a dudas, la necesidad de un método integrado de detección.

Los métodos diagnósticos disponibles actualmente se limitan a la detección de anticuerpos que, por lo general, es retrospectiva y de escasa ayuda en el tratamiento de los pacientes en estados de fase aguda. El cultivo no se considera un método diagnóstico, tanto por su dificultad tecnológica, que lo excluye de las prácticas habituales en un laboratorio de microbiología de hospital, como por la necesidad de instalaciones P3.

El diagnóstico molecular por amplificación de genoma mediante PCR supone una opción diagnóstica de gran valor. Sin embargo, no siempre se dispone de suficiente cantidad de muestras clínicas para ensayos de patógenos o de la metodología necesaria para realizar diferentes ensayos.

Ll DONG-MEI ET AL: "Study on Bartonella infection using molecular biological diagnostic techniques from China" ZHONGHUA LiU XING BING XUE ZAZHI = ZHONGHUA LIUXINGBINGXUE ZAZHI" vol. 25, n° 7, 1 de julio de 2004 (01-07-2004), páginas 602-606 desvela un par de cebadores, cada cebador se une con una región de ARNt conservada en el espaciador 16S - 23S. Se dice que la región entre los ARNt (es decir, la región amplificada por los cebadores) es altamente variable y se distinguen especies diferentes de Bartonella basándose en el amplicón producido (véase Tablas en páginas 604 y 605). El par de cebadores Tlle.455p y TAIa.885n se unen en 464-485 y 894-914 de la secuencia de referencia, respectivamente. Las diferentes especies de Bartonella amplificadas son B. alsatica, B. bacilliformis, B. elizabethae, B. vinsonii vinsonii, B. vinsonii berkhofii, B. vinsonii arupensis, B. tribocorum, B. taylorii, B. quintana, B. koehlerae, B. henselae y B. grahamii

Recientemente se ha publicado un artículo (Blaskovic D. et al. 2005. Oligo-based detection of tick-borne bacteria. FEMS Microbiology Letters 243:273-8), que describe un método para la detección de 5 de los 6 patógenos propuestos por la presente invención. Dicho método está basado en el análisis de ADN ribosómico y emplea cebadores universales, que amplifican el material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son por lo que su sensibilidad es bastante reducida.

Otros métodos, tales como el descrito por las patentes americanas US 6.300.072 y 6.518.020, son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de la misma región de ADN (espacio intergénico 16S-23S) empleada por la presente invención. Sin embargo, el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde la presentación de dichas patentes y su aproximación, que consiste en diferenciar entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies conocidas dentro del género que son de un tamaño similar al fragmento amplificado.

Aunque el método aportado por la presente invención propone también el empleo de la región intergénica 16S-23S para la detección de especies pertenecientes al género Bartonella, se han introducido mejoras respecto de los procedimientos descritos previamente, ya que es capaz de detectar un grupo mucho más amplio de especies dentro

del mismo y otros géneros, utilizando sondas y cebadores completamente novedosos y con niveles de sensibilidad máximos.

Para la detección de Coxiella burnetii, se emplean los mismos cebadores y la misma región de ADN (secuencia de inserción IS1111) que los métodos anteriormente descritos. Se ha mejorado dicha detección combinándola con otra serie de ensayos completamente novedosos para la identificación de otras especies bacterianas, que pueden transmitirse por los mismos vectores, y además aporta una nueva sonda de hibridación para la detección de Coxiella burnetii.

Descripción de la invención

Definiciones: PCR Múltiple o PCR Multiplex: la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es un sistema mediante el que se amplifica o aumenta el número de copias de una secuencia de nucleótidos concreta de un organismo, mediante el uso de dos cebadores. La PCR múltiple o PCR multiplex es una variante de la PCR, que permite la amplificación simultanea de más de una secuencia diana empleando más de un par de cebadores.

La presente invención resuelve el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de bacterias, que causan zoonosis que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit para la detección de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes al género Bartonella.

La solución encontrada por la presente invención consiste en analizar una región del ADN bacteriano para determinar qué especies se encuentran presentes. En concreto, se analiza el espacio intergénico 16S-23S para detectar la presencia de Bartonella.

De acuerdo con lo anterior, se describe un método para la detección de bacterias a partir de una muestra, que comprende las siguientes etapas:

i) poner en contacto la muestra que se analiza con una mezcla de reacción, que contiene cebadores específicos para la realización de PCR Multiplex.

¡i) amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa.

iii) Identificar la formación de los productos de la etapa anterior, siendo dicha información indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.

En relación con esto, se describe un método para detectar:

Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofii, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vnisonii subespecie aurupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori y B. tribocorum,

siendo todas ellas capaces de provocar zoonosis, infectar conjuntamente a un individuo y difíciles de identificar por la simple observación de los cuadros clínicos, basándose en la amplificación y análisis de los genes o regiones génicas concretas presentadas en la tabla 2.

De acuerdo con una realización específica de este primer aspecto de la invención, se amplifican fragmentos de ADN incluidos o comprendidos dentro de las secuencias, cuyos números de referencia se muestran en la tabla 2 posterior.

De acuerdo con una realización más específica, las regiones amplificadas tienen un tamaño de entre 99 y 686 nucleótidos y contienen regiones variables empleadas para la identificación. De acuerdo con una realización aún más específica, las regiones variables contienen o están incluidas dentro de las secuencias SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 76 o secuencias complementarias, cuyas posiciones se muestran en la tabla 2.

1. Un par de cebadores que tienen un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la SEQ ID NO: 8, y capaces de amplificar SEQ ID NO: 61-76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que

pertenecen al género Bartonella.

2. Sonda que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 9-24, y capaz de hibridarcon SEQ ID NO: 61- 76 de especies bacterianas que provocan zoonosis, que pertenecen al género Bartonella.

3. Kit que comprende el par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Kit de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además los cebadores SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53.

5. Kit que comprende la sonda de acuerdo con la reivindicación 2.

6. Kit de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además la sonda SEQ ID NO: 54.