NUEVO INHIBIDOR DE SERINA PROTEASA Y SU USO.
Nuevo inhibidor de serina proteasa y su uso. La invención se refiere a una nueva proteína,
identificada mediante rastreo de una genoteca de cDNA de Anisakis simplex, así como a su secuencia codificante y a sus vectores de expresión. Dicha proteína, miembro de la familia de las serpinas, es capaz de inhibir de manera dependiente de dosis a la trombina humana, sin afectar al factor Xa de la coagulación, y sin que la heparina altere su actividad inhibitoria. Así, la invención se refiere también al uso de esta proteína para la preparación de un medicamento, especialmente si se trata de un anticoagulante. Su administración tendría especial interés en los casos de hipercoagulopatías asociadas a la administración de heparina. Además, representa una alternativa a los anticoagulantes derivados de la cumarina, a los que podría sustituir en cualquiera de las situaciones en las que se administran.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031031.
Solicitante: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III..
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: GÁRATE ORMAECHEA,Teresa, PERTEGUER PRIETO,María Jesús, RODRÍGUEZ DE LAS PARRAS,Esperanza, VALDIVIESO,Elizabeth.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/57 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
- A61P7/02 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 7/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos de la sangre o del fluido extracelular. › Agentes antitrombóticos; Anticoagulantes; Inhibidores de la agregación plaquetaria.
- C07K14/81 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Inhibidores de proteasa.
- C12N15/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inhibidores de proteasas, p. ej. antitrombina, antitripsina, hirudina.
PDF original: ES-2374054_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Nuevo inhibidor de serina proteasa y su uso.
Campo técnico
La invención se inscribe en el campo de la Biotecnología y en la aplicación de moléculas biológicas en el campo clínico. Más concretamente, la invención se refiere a un nuevo inhibidor de serina proteasa aislada del nematodo Anisakis simplex y a su uso como anticoagulante.
Antecedentes de la invención
La cascada de la coagulación sanguínea es un complejo proceso que se desencadena en respuesta a una lesión en un vaso sanguíneo y que comprende una secuencia compleja de reacciones en cadena, en la que participan varios tipos celulares y proteínas solubles de la sangre, y que culmina con la formación de un coágulo que evita la pérdida de sangre a través de la lesión inicial. Se denomina coágulo a una red de proteínas insolubles compuesta por fibrina, en la que quedan atrapadas otras proteínas, agua, sales, plaquetas y otras células sanguíneas, que impide la salida de la sangre hasta que el tejido lesionado se repara.
El proceso de prevención de la pérdida de sangre comienza con la constricción del vaso sanguíneo, para disminuir el flujo sanguíneo al área de la lesión. A continuación, cuando las plaquetas entran en contacto con las fibras de colágeno expuesto debido a la ruptura del recubrimiento epitelial de los vasos, se produce su agregación, uniéndose al colágeno para formar un tapón plaquetario, así como su activación, que da lugar a que se liberen distintos factores como el tromboxano A2, inductor de la agregación plaquetaria, así como fosfolípidos, lipoproteínas y otras proteínas importantes de la cascada de coagulación.
La cascada de coagulación propiamente dicha, que conduce a la formación de la malla de fibrina que recubre al tapón, es una secuencia de reacciones proteolíticas que se inicia mediante sustancias activadoras secretadas por el vaso, por las plaquetas y por proteínas sanguíneas adheridas a la pared del vaso. Tal como se esquematiza en la Fig. 1, la cascada de coagulación está formada por dos vías, cuya denominación hace referencia al lugar en donde se inicia la cascada de coagulación en cada una de ellas: la vía extrínseca (que se inicia fuera del vaso sanguíneo, cuando el factor VII activo (VIIa) se une al factor tisular (TF) o tromboplastina de las membranas de las células que están fuera de los vasos y originan el complejo VIIa/TF) y la vía intrínseca (que se activa en el interior del vaso sanguíneo, por el contacto de la pared del mismo con las partículas de lipoproteínas y quilomicrones). Ambas vías confluyen en la formación de factor X activo (Xa), que da lugar a la conversión de la protrombina en trombina, enzima responsable de la transformación del fibrinógeno en la fibrina que finalmente genera el coágulo.
La trombina, por ello, es considerada a menudo la enzima clave de la coagulación, por ser la proteasa que da lugar a la formación de fibrina al actuar sobre el fibrinógeno. Se trata de una serina proteasa, es decir, una hidrolasa que degrada enlaces peptídicos y que posee en su centro activo un resto de serina esencial para la catálisis enzimática. Se genera por la acción del factor Xa sobre la protrombina, una glicoproteína que se sintetiza en el hígado y que requiere vitamina K como cofactor para su síntesis.
Otros factores de coagulación también necesitan vitamina K para su síntesis en el hígado, por lo que el déficit en esta vitamina puede afectar seriamente a la coagulación de la sangre, dando lugar a aparición de hemorragias.
Adicionalmente a los factores de coagulación, existen otras proteínas muy importantes para el control del proceso: las del sistema anticoagulante, que evita la formación de trombos o émbolos y la oclusión de las zonas no dañadas, confinando la formación del coágulo a la zona lesionada. La proteína C, la proteína S, la trombomodulina (TM) y la antitrombina (AT) son elementos importantes de este sistema.
La antitrombina III en particular se considera la principal inhibidora fisiológica de la coagulación. Es una glicoproteína que se sintetiza en el hígado sin depender de la vitamina K y que actúa inhibiendo irreversiblemente a varios factores procoagulantes activos, entre los cuales está la trombina, pero también el factor Xa, la calicreína y los factores XIa y XIIa. La actividad de la antitrombina III es uno de los mecanismos fisiológicos principales de control de la cantidad de trombina, aunque otros inhibidores, como el cofactor II de la heparina humana (HCII), también tienen relevancia en ese aspecto. La acción de la antitrombina, que se produce por la formación de complejos con los factores de coagulación a los que inhibe, se incrementa notablemente en presencia de heparina, un heteropolisacárido presente en el endotelio de los vasos sanguíneos y en los gránulos de las células cebadas, que facilita la unión de la antitrombina III con los correspondientes factores procoagulantes activos.
Existen diversas situaciones clínicas en las que es conveniente retrasar o impedir la coagulación de la sangre. Para ello, se han empleado tradicionalmente distintos fármacos anticoagulantes, que son compuestos que dificultan o impiden la agregación plaquetaria o algún otro paso de la cascada de la coagulación. Destaca entre ellos la propia heparina, un compuesto fisiológico presente en gran cantidad en los mamíferos, que alarga el tiempo de coagulación, y cuya administración se suele utilizar cuando se precisa de acción anticoagulante rápida y por poco tiempo, como puede ser en la prevención de trombosis venosas de cirugía, donde se utiliza a bajas dosis.
La administración de heparina, sin embargo, no siempre es recomendable, pues puede dar lugar a estados de hipercoagulabilidad. Así, por ejemplo, entre los pacientes a los que se les administra heparina en el período preoperatorio, como pueden ser los que van a ser sometidos a un bypass cardiopulmonar, se ha observado que un porcentaje de ellos presenta un déficit significativo de antitrombina III y necesitan reposición de la misma previa a la realización de la intervención, bien en forma de plasma fresco congelado, bien como concentrado de antitrombina III: la administración previa de heparina, para potenciar la acción anticoagulante de la antitrombina III, ocasiona el consumo de la antitrombina y una disminución progresiva de la misma. También se observa reducción de la antitrombina III en los pacientes que sufren enfermedad hepática, en coagulopatías de consumo con CID (coagulación intravascular diseminada) y en caso de hemorragias masivas, dando lugar a un aumento del riesgo de episodios trombóticos perioperatorios. Por ello, también en estos casos se realiza reposición de la antitrombina III, mediante el uso de plasma fresco congelado o concentrados de antitrombina. Aunque, en general, se considera que el tratamiento previo al que se someten los concentrados de antitrombina III disponibles en Europa y Estados Unidos hace que sea prácticamente nulo el riesgo de transmisión de agentes infecciosos, siempre existe un riesgo residual y además son productos extremadamente caros, por lo que dan lugar a un sensible aumento de los costes del tratamiento.
Otro estado de hipercoagulabilidad, muy temido en pacientes críticamente enfermos, es la trombosis relacionada con la trombopenia asociada a la heparina. La heparina provoca un grado leve de trombocitopenia, trastorno que se ha comprobado que es mediado por un anticuerpo que estimula la agregación y activación plaquetaria en presencia de heparina. Los pacientes que padecen este trastorno suelen sufrir episodios venosos, así como accidentes arteriales trombóticos graves. Si el síndrome no se identifica en seguida, puede conducir a la pérdida de miembros, infartos viscerales y cardíacos e, incluso, mortalidad en grado elevado. Su tratamiento incluye el cese inmediato de la administración de heparina, sustituyéndola en ocasiones por heparina de bajo peso molecular (que tiene predominantemente una actividad anti-factor Xa, aunque es también dependiente de antitrombina III) o combinándola con hirudina para disminuir la dosis administrada; también puede utilizarse el tratamiento antiagregante con ácido acetilsalicílico como alternativa.
Todos estos problemas han llevado a que se busquen alternativas con las que sustituir la heparina.
Otros anticoagulantes de uso común son los anticoagulantes dicumarínicos, los cuales son inhibidores de la vitamina K, lo que da lugar a que aparezcan en la sangre formas inactivas de los factores en cuya síntesis interviene dicha vitamina. Así,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende:
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:3.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta estructura de serpina con capacidad de inhibir a la trombina humana, en el que dicha secuencia es idéntica a SEQ ID NO:3 en un porcentaje que se selecciona del grupo del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5% y 99,9%.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta estructura de serpina con capacidad de inhibir a la trombina humana, en el que dicha secuencia es idéntica a SEQ ID NO:2 en un porcentaje que se selecciona del grupo del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5% y 99,9%.
6. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una proteína de fusión que comprende la secuencia de una segunda proteína.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que la segunda proteína es la glutatión-S-transferasa.
8. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuya capacidad de inhibición de la trombina humana no se ve afectada por la presencia de heparina.
9. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta también capacidad de inhibir las catepsinas G y L.
10. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una serpina con capacidad de inhibir la trombina humana seleccionada del grupo que consiste en:
11. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10, que comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica idéntica a la representada por SEQ ID NO:3.
12. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10, que comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica idéntica a la representada por SEQ ID NO:2.
13. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO: 1.
14. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10, que comprende un fragmento de secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es idéntica a la representada por SEQ ID NO:2 al menos en un porcentaje que se selecciona del grupo de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5% y 99,9%.
15. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.
16. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión de la reivindicación 15.
17. Célula hospedadora según la reivindicación 16, que es una bacteria, una levadura, o una célula eucariótica.
18. Un método para producir una proteína que comprende las etapas de:
19. Uso de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que el medicamento está destinado a ser utilizado como anticoagulante.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que el medicamento está destinado a pacientes en los que se sospeche que puede haber alguna alteración en proteínas de la cascada de coagulación distintas de la trombina, a pacientes inmunodeprimidos, a pacientes con trastornos hepáticos, a pacientes con coagulopatías de consumo con coagulación intravascular diseminada, a pacientes que presenten estados de hipercoagulabilidad asociados al uso de heparina o a pacientes con déficit de antitrombina III.
22. Uso según la reivindicación 20, en el que el medicamento está destinado a ser administrado como anticoagulante durante períodos perioperatorios.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que el medicamento está destinado a ser administrado durante el período perioperatorio de la cirugía cardiopulmonar, y de la cirugía traumatológica.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que el medicamento está destinado a ser administrado durante el período perioperatorio de la cirugía traumatológica en tratamientos de sustitución completa de cadera y rodilla.
25. Uso según la reivindicación 19, en el que el medicamento está destinado a pacientes con síndrome coronario agudo, fibrilación auricular, enfermedad coronaria crónica, prótesis mecánicas o articulares y válvulas cardíacas o vasculares.
26. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que el medicamento está destinado a ser administrado sin la administración simultánea de heparina.
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