METODO PARA LA REPLICACIÓN, AMPLIFICACIÓN, O SECUENCIACIÓN DE UN ADN MOLDE.

Método para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con una ADN polimerasa del tipo 29 y a un kit para llevar a cabo dicho método. Estado de la técnica anterior La única enzima requerida por el bacteriófago 29 para replicar su genoma es su ADN polimerasa, una proteína monomérica de 66 KDa, capaz de catalizar tanto la iniciación de la replicación como la elongación de la cadena sintetizada. Para la iniciación, esta polimerasa se une a una proteína denominada terminal (TP), reconoce el extremo del ADN de 29 y cataliza la formación de un complejo covalente TP-dAMP. Tras la polimerización de 10 nucleótidos, se disocia el heterodímero ADN polimerasa/TP y se lleva a cabo la elongación de la cadena naciente de ADN. Las ADN polimerasas replicativas requieren la interacción con proteínas accesorias que estabilizan la unión entre la enzima y el ADN (Kuriyan y ODonnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915-925). Por otro lado, dichas ADN polimerasas necesitan acoplar la polimerización al desplazamiento de la cadena de ADN que no está siendo copiada, para lo cual requieren su asociación funcional a proteínas tipo helicasa. En este sentido, la ADN polimerasa del bacteriófago 29 presenta varias características funcionales intrínsecas que la hacen única: a) Elevada procesividad (definida como el número de nucleótidos incorporados por evento de unión). b) Alta capacidad de desplazamiento de cadena, lo que le permite replicar el genoma de dicho bacteriófago en ausencia de proteínas accesorias tipo helicasa. Estas dos características, procesividad y desplazamiento de cadena permiten que la ADN polimerasa de 29 sea capaz de sintetizar cadenas de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940). c) Alta fidelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena (Esteban et al. J Biol Chem. 1993; 268: 2719- 2726). Todas estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos de procesos isotérmicos (a temperatura constante) para la amplificación de ADN de doble cadena (ADNbc), basados en el uso de esta polimerasa. En una configuración simple, la capacidad de la ADN polimerasa de 29 para usar ADN de cadena sencilla (ADNmc) circular permite una amplificación de ADN por el método del circulo rodante (o, RCA de las siglas en inglés de rolling-circle amplification), originando moléculas de ADNmc de gran longitud y que contienen más de 10 copias del molde circular (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940; US5001050, US5198543 y US5576204). En el procedimiento de amplificación de ADNbc desarrollado por Amersham Biosciences/Molecular Staging (Dean et al. Genome Res. 2001; 11: 1095-1099; Dean et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 5261-5266), la combinación del uso de la ADN polimerasa de 29 con el de hexámeros (hexa-nucleótidos) cebadores de secuencias al azar, permiten obtener factores de amplificación de 10 4 -10 6 partiendo de picogramos de ADN plasmídico circular [Templiphi de GE Healthcare] o de 10 nanogramos de ADN genómico [Genomiphi de GE Healthcare y Repli-G ® de Qiagen], Los productos originados son de alta calidad y pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa, habiéndose demostrado que la ADN polimerasa de 29 es la enzima más robusta para este fin. El tampón habitual para llevar a cabo las reacciones de amplificación con la ADN polimerasa de 29 contiene Tris-HCI (pH 7,5) más distintas concentraciones (en el orden milimolar) de NaCl o KCl y MgCl 2 (US20030207267). Sin embargo, a pesar de la bondad de estos protocolos en situaciones muy diversas, es una necesidad creciente el desarrollar otros que permitan partir de cantidades menores de ADN. Explicación de la invención La presente invención se refiere a un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con una ADN polimerasa del tipo 29 y a un kit para llevar a cabo dicho método. La ADN polimerasa del fago 29 presenta varias características de gran interés para la amplificación de ADN como son: una elevada procesividad sin necesidad del concurso de ninguna proteína accesoria y una alta capacidad de desplazamiento de cadena que le permiten replicar el genoma de dicho bacteriófago en un solo evento de unión al ADN, así como una alta fidelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena. Estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos para la amplificación isotérmica de ADN, basados en el uso de esta polimerasa que permiten la obtención de productos de alta calidad que pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa. Sin embargo, existe una necesidad de protocolos que permitan la amplificación de ADN a partir de cantidades menores del mismo. La presente invención responde a esta necesidad mediante el desarrollo de un método de amplificación de ADN que mejora significativamente la especificidad y el rendimiento de la reacción. En los ejemplos de esta patente se muestra que la adición simultánea de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween ® 20) y una sal de amonio al tampón usado habitualmente para la amplificación con la ADN polimerasa de 29, 2 ES 2 351 294 A1 por un lado, evita la amplificación inespecífica de ADN y, por otro, permite la amplificación detectable y específica a partir de cantidades límite de 0,1 femtogramos (fg) de ADN plasmídico y 10 fg de ADN genómico como molde. Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos: a) una ADN polimerasa del tipo 29, b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado, c) una sal de amonio, d) un tampón, e) cloruro magnésico, f) un cebador, y g) nucleósidos trifosfato. Una realización preferida de este aspecto de la invención, se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende los elementos (a)-(g) mencionados anteriormente y que además comprende una sal de potasio. Preferiblemente, dicha sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico. El término ADN polimerasa, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una enzima capaz de catalizar la polimerización de desoxinucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima inicia la síntesis en el extremo 3 de un cebador hibridado con una secuencia de ADN molde, y procede en dirección al extremo 5 de la hebra del ADN molde. El término ADN polimerasa del tipo 29, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier ADN polimerasa que contiene subdominios TPR1 y TPR2 en su dominio de polimerización, que proporcionan a la polimerasa la capacidad de acoplar la polimerización procesiva al desplazamiento de cadena. Ejemplos de ADN polimerasas del tipo 29 que pueden ser empleadas en la presente invención se seleccionan de la lista que comprende las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: 29, Cp-1, PRD-1, 15, 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA- 1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV). En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo 29 se selecciona de entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: 29, Cp-1, PRD- 1, 15, 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV). En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo 29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 80% con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, la ADN polimerasa del tipo 29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 90% con la SEQ ID NO: 1. En una realización aún más preferida, la ADN polimerasa del tipo 29 tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. El dominio exonucleasa de las ADN polimerasas del tipo 29 es conocido y puede ser modificado para reducir la actividad exonucleasa reteniendo una alta procesividad y capacidad de desplazamiento de cadena. Estas ADN polimerasas modificadas son especialmente útiles para secuenciar moléculas largas. En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo 29 presenta una modificación en el dominio exonucleasa, donde... [Seguir leyendo]

1. Método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos: a) una ADN polimerasa del tipo 29, b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado, c) una sal de amonio, d) un tampón, e) cloruro magnésico, f) un cebador, y g) nucleósidos trifosfato. 2. Método según la reivindicación 1 donde la mezcla de reacción además comprende una sal de potasio. 3. Método según la reivindicación 2 donde la sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,003% y el 0,1% del volumen total de la reacción. 5. Método según la reivindicación 4 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,006% y el 0,05% del volumen total de la reacción. 6. Método según la reivindicación 5 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,01% y el 0,03% del volumen total de la reacción. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la sal de amonio se selecciona de la lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio. 8. Método según la reivindicación 7 donde la sal de amonio es sulfato de amonio. 9. Método según la reivindicación 8 donde el sulfato de amonio está a una concentración de entre 30 mM y 60 mM. 10. Método según la reivindicación 9 donde el sulfato de amonio está a una concentración de entre 40 mM y 50 mM. 11. Método según la reivindicación 7 donde la sal de amonio es cloruro de amonio o acetato de amonio. 12. Método según la reivindicación 11 donde el cloruro de amonio o el acetato de amonio está a una concentración de entre 60 mM y 120 mM. 13. Método según la reivindicación 12 donde el cloruro de amonio o el acetato de amonio está a una concentración de entre 80 mM y 100 mM. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la ADN polimerasa del tipo 29 se selecciona de entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: 29, Cp-1, PRD-1, 15, 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o ABV. 15. Método según la reivindicación 14 donde la ADN polimerasa del tipo 29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 80% con la SEQ ID NO: 1. 16. Método según la reivindicación 15 donde la ADN polimerasa del tipo 29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 90% con la SEQ ID NO: 1. 17. Método según la reivindicación 16 donde la ADN polimerasa del tipo 29 tiene la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 1. 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 donde la ADN polimerasa del tipo 29 presenta una modificación en el dominio exonucleasa y donde dicha ADN polimerasa modificada tiene menos del 10% de actividad exonucleasa que la correspondiente ADN polimerasa de origen natural. ES 2 351 294 A1 19. Método según la reivindicación 18 donde la ADN polimerasa del tipo 29 modificada tiene menos del 1% de actividad exonucleasa que la correspondiente ADN polimerasa de origen natural. 20. Método según la reivindicación 19 donde la ADN polimerasa del tipo 29 modificada carece de actividad exonucleasa detectable con respecto a la correspondiente ADN polimerasa de origen natural. 21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 donde el tampón es Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 donde el tampón está a un pH de entre 7 y 8,5. 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 donde el cloruro magnésico está a una concentración de entre 2 mM y 20 mM. 24. Método según la reivindicación 23 donde el cloruro magnésico está a una concentración de entre 5 mM y 15 mM. 25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24 donde el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 30 mM y 70 mM. 26. Método según la reivindicación 25 donde el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 40 mM y 60 mM. 27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 donde los nucleósidos trifosfato son dCTP, dGTP, dTTP y dATP. 28. Método según la reivindicación 27 donde los nucleósidos trifosfato dCTP, dGTP, dTTP y dATP se encuentran en cantidades equimolares. 29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 donde el cebador es arbitrario y está protegido contra la acción de exonucleasas. 30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 donde el ADN molde es ADN plasmídico. 31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 donde el ADN molde es ADN genómico. 32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 donde la amplificación se realiza a una temperatura esencialmente constante entre 25 y 40ºC. 33. Método de amplificación de un ADN molde según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 donde la amplificación tiene lugar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación mediante lazo (LAMPA). 34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 donde, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado. 35. Kit para llevar a cabo un método según las reivindicaciones 1 a 34 que comprende: a) una ADN polimerasa del tipo 29, b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado, c) una sal de amonio, d) un tampón, y e) cloruro magnésico. 36. Kit según la reivindicación 35 que además comprende una sal de potasio. 37. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36 que además comprende un cebador. 38. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 que además comprende el cebador según la reivindicación 29. 39. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38 que además comprende nucleósidos trifosfato. 40. Kit según las reivindicaciones 37 a 39 donde, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado. 11 ES 2 351 294 A1 12 ES 2 351 294 A1 13 ES 2 351 294 A1 14 ES 2 351 294 A1 LISTA DE SECUENCIAS <110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) <120> Método para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. <130> ES1641.386.2 <160> 1 <170> PatentIn versión 3.5 <210> 1 <211> 572 <212> PRT <213> Bacteriophage phi-29 <400> 1 1 ES 2 351 294 A1 2 ES 2 351 294 A1 3 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA