Método para amplificar ácido nucleico, que comprende:

a) hibridar un cebador a un molde,

presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde;

b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización a la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo del molde, presentando el polinucleótido el cebador en un primer extremo del mismo y un segundo extremo;

c) separar el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) del molde;

d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador;

e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en el que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3''; y

f) amplificar el polinucleótido extendido usando un cebador único que tiene la secuencia predeterminada

Moldes modificados mediante ingeniería genética y su uso en amplificación de cebador único.

Campo técnico

La presente descripción se refiere a moldes modificados mediante ingeniería genética útiles para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana. Más específicamente, los moldes que se modifican mediante ingeniería genética para contener secuencias complementarias en sus extremos opuestos se proporcionan mediante una reacción de extensión con oligonucleótidos anidados (NOER). El molde modificado mediante ingeniería genética permite la Amplificación con Cebador Único (SPA) para amplificar una secuencia diana dentro del molde modificado mediante ingeniería genética. En formas de realización particularmente útiles, las secuencias diana de los moldes modificados mediante ingeniería genética se clonan en vehículos de expresión para proporcionar una librería de polipéptidos o proteínas, tal como, por ejemplo, una librería de anticuerpos.

Antecedentes de la técnica relacionada

Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de productos de la amplificación ayudan en la detección, identificación, cuantificación y análisis de secuencias de las secuencias de ácidos nucleicos. La amplificación de ácidos nucleicos es una etapa importante en la construcción de librerías a partir de genes relacionados, tales como, por ejemplo, anticuerpos. Estas librerías se pueden identificar en busca de anticuerpos que tienen actividades específicas, deseables. El análisis de ácidos nucleicos es importante para la detección e identificación de patógenos, la detección de una alteración génica que conduce a fenotipos definidos, el diagnóstico de enfermedades genéticas o la susceptibilidad a una enfermedad, la evaluación de la expresión génica en desarrollo, enfermedad y en respuesta a estímulos definidos, así como los diversos proyectos genómicos. Otras aplicaciones del método de amplificación de ácidos nucleicos comprenden la detección de células raras, la detección de patógenos, y la detección de la expresión génica alterada en tumores, y similares. La amplificación de ácidos nucleicos también es útil para el análisis cualitativo (tal como, por ejemplo, la detección de la presencia de secuencias de ácido nucleico definidas) y la cuantificación de secuencias génicas definidas (útil, por ejemplo, en la evaluación de la cantidad de secuencias patógenas, así como la determinación de la multiplicación o supresión génica, y la transformación celular desde un tipo celular normal a neoplásico, etc.). La detección de alteraciones de secuencias en una secuencia de ácido nucleico es importante para la detección de genotipos mutantes, tan importante para el análisis genético, la detección de mutaciones que conducen a resistencia a fármacos, farmacogenómica, etc.

Hay muchas variaciones de la amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo la amplificación exponencial, la amplificación lineal enlazada, la amplificación a base de ligación, y la amplificación a base de transcripción. Un ejemplo de método de amplificación exponencial de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha descrito en numerosas publicaciones. Véase, por ejemplo, Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Mullis K., documento EP 201.184; Mullis et al., patente US nº 4.582.788; Erlich et al., documentos EP 50.424, EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; y Saiki R. et al., patente US nº 4.683.194. De hecho, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el método de amplificación diana más usado habitualmente. La PCR se basa en múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de dos cebadores oligonucleotídicos diferentes, cada uno a una hebra opuesta de las hebras diana, y la extensión de los cebadores mediante una polimerasa nucleotídica para producir múltiples copias bicatenarias de la secuencia diana.

También se han descrito métodos de amplificación que emplean un único cebador. Véanse, por ejemplo, las patentes US n^os 5.508.178; 5.595.891; 5.683.879; 5.130.238; y 5.679.512. El cebador puede ser un cebador quimérico de ADN/ARN, como se describe en la patente US nº 5.744.308.

Algunos métodos de amplificación usan oligonucleótidos de cambio de molde (TSO) y oligonucleótidos bloqueantes. Por ejemplo, en las patentes US nº 5.679.512; nº 5.962.272; nº 6.251.639 y en Patel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2969-2974 (1996) se describe una amplificación de cambio de molde en la que se utiliza un cebador de ADN quimérico.

Sin embargo, los métodos de amplificación diana descritos previamente adolecen de varios inconvenientes. Por ejemplo, los métodos de amplificación a base de transcripción, tales como la Amplificación a Base de Secuencias de Ácidos Nucleicos (NASBA) y la amplificación mediada por transcripción (TMA), están limitados por la necesidad de incorporar la secuencia del promotor de la polimerasa en el producto de amplificación mediante un cebador, un proceso que tiene tendencia a dar como resultado una amplificación no específica. Otro ejemplo de un inconveniente de los métodos actuales de amplificación es el requisito de dos sucesos de unión que pueden tener una unión óptima a diferentes temperaturas, así como el uso de cebadores que contienen secuencias de origen natural. Esta combinación de factores da como resultado el aumento de la probabilidad de un cebado erróneo y la amplificación resultante de secuencias distintas de la secuencia diana.

Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos que superen estos inconvenientes. La invención proporcionada en la presente memoria satisface esta necesidad y proporciona beneficios adicionales.

Sumario

Ahora se han descubierto nuevos métodos para amplificar ácido nucleico, que comprenden las etapas de: a) hibridar un cebador a una secuencia de ácido nucleico molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde, y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde; b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo del molde, presentando el polinucleótido un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo incorpora el cebador; c) separar del molde el polinucleótido sintetizado en la etapa (b); d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido, y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador; e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en la que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y f) amplificar el polinucleótido extendido usando un único cebador que tiene la secuencia predeterminada.

En una forma de realización alternativa, el método comprende las etapas de a) hibridar un cebador y un oligonucleótido frontera a una secuencia de ácido nucleico molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde, y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde; b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y la porción del molde a la que se hibrida el oligonucleótido frontera, presentando el polinucleótido un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo incorpora el cebador; c) separar del molde el polinucleótido sintetizado en la etapa (b); d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido, y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador; e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en la que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y f) amplificar el polinucleótido extendido usando un único cebador que tiene la secuencia predeterminada.

También se contempla que una hebra de ácido nucleico modificada mediante...

1. Método para amplificar ácido nucleico, que comprende:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de hibridar un oligonucleótido molde comprende proporcionar una colección de oligonucleótidos molde que tienen diferentes secuencias, y poner en contacto la colección de oligonucleótidos molde con el polinucleótido sintetizado en la etapa (b).

3. Método según la reivindicación 1, en el que el molde se digiere antes de hibridarse al cebador.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) se digiere antes de hibridarlo al oligonucleótido molde.

5. Método para amplificar ácido nucleico, que comprende:

6. Método según la reivindicación 5, en el que la etapa de hibridar un oligonucleótido molde comprende proporcionar una colección de oligonucleótidos molde que tienen diferentes secuencias, y poner en contacto la colección de oligonucleótidos molde con el polinucleótido sintetizado en la etapa (b).

7. Método para producir una librería de anticuerpos, que comprende:

8. Método según la reivindicación 1 ó 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde no se hibrida al polinucleótido sintetizado en la etapa (b).

9. Método según la reivindicación 1 ó 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde comprende bases modificadas que evitan la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde.

10. Método según la reivindicación 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido frontera no se hibrida al molde.

11. Método según la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido frontera comprende un ácido nucleico bloqueado que evita la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido frontera.

12. Método según la reivindicación 7, en el que el extremo 3' de dicho por lo menos un oligonucleótido molde no se hibrida al polinucleótido sintetizado en la etapa (c).

13. Método según la reivindicación 7, en el que el extremo 3' de dicho por lo menos un oligonucleótido molde comprende bases modificadas que evitan la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde.