PROCEDIMIENTO PARA LA AMPLIFICACION DE INFORMACION GENETICA POR MEDIO DE CEBADORES QUE SE UNEN EN VARIOS SITIOS EN EL GENOMA.

Procedimiento para la determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un material genético,

siendo amplificado el material genético mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en la que se utilizan unos cebadores, que son complementarios con unos sitios de fijación a cebadores, que están presentes en el material genético en varios sitios, y que están en cada caso contiguos con respecto a una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica en cada caso un conjunto parcial, de tal manera que se obtiene un producto de amplificación, que en lo esencial tiene solamente unas secuencias amplificadas, que comprenden una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica para la respectiva información genética, la cual es adecuada para la detección mediante hibridación, siendo analizado el producto de amplificación mediante un experimento de hibridación para la determinación de la frecuencia relativa de los conjuntos parciales delimitables

Procedimiento para la amplificación de información genética por medio de cebadores que se unen en varios sitios en el genoma.

El presente invento se refiere a procedimientos para la determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un material genético.

Unos conjuntos parciales dentro de un material genético son, por ejemplo, los cromosomas dentro de un genoma. En este caso, un cromosoma constituye un conjunto parcial procedente de un genoma, que contiene varios cromosomas diferentes. Unos conjuntos parciales delimitables pueden ser también supresiones o respectivamente inserciones dentro de un cromosoma individual. En este caso, las supresiones o respectivamente las inserciones constituyen los conjuntos parciales delimitables y el cromosoma individual constituye el material genético. Unas Informaciones genéticas de un cromosoma son p.ej. unas secuencias dianas, que sólo se pueden presentar en este cromosoma, es decir, que son específicas de este cromosoma.

Un sistema, en el que los conjuntos parciales delimitables constituyen diferentes cromosomas de un genoma, es p.ej. un corpúsculo polar.

Los corpúsculos polares se forman en los vertebrados al realizarse la formación y la maduración de los óvulos, que son requeridos para la reproducción de una respectiva especie.

En el caso de los seres humanos, a las parejas o a las mujeres que no tienen hijos, se les puede ofrecer una reproducción asistida, para satisfacer su deseo de tener hijos. Para ello, actualmente están a disposición varios procedimientos, que conducen a una tasa promedia de embarazos de aproximadamente 10% por cada óvulo. Unos análisis indirectos, llevados a cabo a través de los corpúsculos polares, han mostrado que los óvulos tienen en un alto porcentaje una distribución errónea para cromosomas individuales. Estas aneuploidías conducen a unos embriones que no son capaces de sobrevivir, y constituyen presuntamente el fundamento de la baja tasa de implantación después de una reproducción asistida.

En la población, aproximadamente un 10% de todas las parejas no tienen hijos indeseadamente. Los motivos de esta infertilidad se encuentran, por una parte, en defectos orgánicos en las mujeres y los varones, pero ella también puede tener unas causas genéticas. Hasta un 70% de las interrupciones del embarazo pueden tener motivos genéticos, haciéndose responsables de ello en la mayoría de los casos a unas distribuciones cromosómicas erróneas (Griffin 1996).

Estas aneuploidías cromosómicas resultan en la mayoría de los casos a partir de una ovogénesis perturbada (Angell 1993). En el caso de la espermiogénesis se encuentran células aneuploides sólo en un 2-4% (Zenzes 1992). Esta y otras causas conducen a que, en unas condiciones naturales, un alto porcentaje de todos los óvulos fecundados no conduzca a un embarazo intacto.

Tal como ya se ha expuesto más arriba, a las parejas o mujeres que no tienen hijos, se les puede ofrecer una fecundación in vitro u otra técnica distinta de reproducción asistida, tal como p.ej. la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), pudiéndose alcanzar con los métodos de fecundación in vitro, que están a disposición actualmente, una tasa promedia de embarazos de 10% por cada óvulo. La evaluación de unos estudios extensos ha mostrado que la tasa de embarazos en el caso de las mujeres con una edad de más que 35 años disminuye manifiestamente, y que en el caso de las mujeres con una edad de más que 40 años, ésta se sitúa por debajo de 10%. Esto está en concordancia con la observación de que las madres presentan a partir de la edad de 35 años un riesgo aumentado de tener un hijo con una distribución cromosómica errónea.

En el diagnóstico prenatal sólo son diagnosticados los niños que tienen una distribución cromosómica errónea, que son capaces de vivir por lo menos hasta el momento del diagnóstico. Así, p.ej. en el momento de la amniocentesis se encuentran más niños con trisomías o monosomías que en el momento del parto, puesto que muchos de estos niños fallecen en el transcurso del embarazo.

Si se consideran solamente las trisomías, entonces en lo esencial solamente son capaces de vivir los niños que tienen una trisomía 21 o que tienen un cromosoma X o respectivamente Y excedente o ausente. Las pequeñas tasas de implantación, antes mencionadas, podrían estar fundamentadas por aneuploidías de los óvulos también para otros cromosomas, que o bien no conducen a ninguna implantación, o que conducen a un aborto muy temprano. Este hecho es apoyado por análisis cromosómicos en materiales procedentes de abortos.

Durante la maduración del óvulo, el óvulo diploide inicial tiene que reducir su grupo de cromosomas. Este proceso tiene lugar en las divisiones de maduración primera y segunda. En la primera división de maduración (1ª división de reducción) son separados los cromosomas homólogos. En la segunda división de maduración se efectúa la separación de los cromátidos. El material genético de las células hijas, que resultan en este caso, es transferido al espacio perivitelino del óvulo en cada caso en forma de los corpúsculos polares. Los corpúsculos polares corresponden en su estructura a una célula, pero tienen una proporción solamente mínima en el citoplasma. El primer corpúsculo polar resulta durante la ovulación, y el segundo corpúsculo polar es expulsado a las 3-4 h después de la penetración del espermatozoide en el óvulo. Los dos corpúsculos polares se diferencian en la cantidad de su material genético. El primer corpúsculo polar contiene 23 cromosomas con dos cromátidos (2n), mientras que el segundo así como también el óvulo maduro sólo tienen 23 cromosomas sencillos con solamente un cromátido (1n). Los corpúsculos polares no tienen ninguna función y son resorbidos en el desarrollo embrionario temprano. No se conoce ninguna importancia biológica del corpúsculo polar para el embrión (véase el resumen de "Preimplantation Genetic Diagnosis, Polar Body Biopsy" (Diagnóstico genético previo a la implantación, biopsia de corpúsculos polares) de The First World Congress On: Controversies in Ostetrics, Gynecology & Infertility (Primer congreso mundial sobre controversias en la obstetricia, la ginecología y la infertilidad), Praga, República Checa - 1999 de Y. Verlinsky, A. Kuliew y panfleto acerca del diagnóstico de corpúsculos polares del centro médico Pränatal Medizin München, de Dr. Med Karl-Philip Gloning y colaboradores. En el resumen de "Preimplantation Genetic Diagnosis, Polar Body Biopsy" de The First World Congress On: Controversies in Ostetrics, Gynecology & Infertility, Praga, República Checa - 1999 de Y. Verlinsky y A., Kuliew, se divulga la investigación de los corpúsculos polares primero y segundo mediante un ensayo secuencial (del inglés "sequential testing", lo que presupone una extracción del corpúsculo polar. A partir de 179 embarazos artificiales exitosos resultaron 135 niños sanos, que no habían sufrido daños de ningún tipo mediante esta intervención.

M. Montag, K. van der Ven, H. van der Ven "Erste klinische Erfahrungen mit der Polkörperchendiagnostik in Deutschland" (Primeras experiencias clínicas con el diagnóstico de corpúsculos polares en Alemania) informan acerca de sus primeras experiencias con el diagnóstico de corpúsculos polares en Alemania, según las cuales, las tasas de embarazos son agradablemente altas mediando inclusión del diagnóstico de corpúsculos polares.

La cita "Einführung in die Präimplantationsdiagnostik" (Introducción al diagnóstico antes de la implantación), E. Schwinger, Lübeck, Alemania, fuente: http://www.studgen.uni-mainz.de/manuskripte/schwinger.pdf., describe que no se puede comprobar ningún aumento de la tasa de malformaciones después de un diagnóstico antes de la implantación (PID) mediante un análisis de los corpúsculos polares o de los blastocitos. El documento ilustra los estrechos intervalos de tiempo que están a disposición en el caso de un diagnóstico antes de la fecundación (PFD).

De acuerdo con un panfleto acerca del diagnóstico de corpúsculos polares del Pränatal Medizin München, Dr. Med Karl-Philip Gloning y colaboradores, los datos publicados hasta ahora apuntan a que una extracción de corpúsculos polares no está vinculada con ningún aumento digno de mención del riesgo básico general de perturbaciones del desarrollo, que es de 2 - 4%.

Por lo tanto, ya existen individuos humanos que han procedido de unos óvulos, a los que se les había extraído el primer corpúsculo polar, que...

1. Procedimiento para la determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un material genético, siendo amplificado el material genético mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en la que se utilizan unos cebadores, que son complementarios con unos sitios de fijación a cebadores, que están presentes en el material genético en varios sitios, y que están en cada caso contiguos con respecto a una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica en cada caso un conjunto parcial, de tal manera que se obtiene un producto de amplificación, que en lo esencial tiene solamente unas secuencias amplificadas, que comprenden una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica para la respectiva información genética, la cual es adecuada para la detección mediante hibridación, siendo analizado el producto de amplificación mediante un experimento de hibridación para la determinación de la frecuencia relativa de los conjuntos parciales delimitables.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque la homología entre los cebadores y los respectivos sitios de fijación a cebadores se sitúa en un intervalo de 80% - 100%, y de manera preferida en un intervalo de 90% - 100%.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2,

caracterizado porque en el transcurso de la reacción en cadena de la polimerasa se utilizan unos eslabones de nucleótidos provistos de marcaciones.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3,

caracterizado por