Método para diagnosticar o determinar la predisposición genética a desarrollar miocardiopatía hipertrófica.

El método para diagnosticar o determinar la predisposición genética de un sujeto a desarrollar miocardiopatía hipertrófica (MCH), tanto familiar como esporádica, se basa en la identificación de mutaciones puntuales en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociadas con el desarrollo de MCH. Dicho método constituye una herramienta de diagnóstico útil que es particularmente importante cuando se estudian sujetos asintomáticos con sospecha de tener la enfermedad. Los sujetos sintomáticos pueden ser diagnosticados por un médico. Los sujetos asintomáticos procedentes de familias con una historia de MCH pueden ser estudiados selectivamente usando este método lo que permite disponer de un diagnóstico antes de la aparición de la enfermedad. A los individuos que posean la mutación asociada con la enfermedad se les pueden aconsejar pautas de comportamiento apropiadas

Método para diagnosticar o determinar la predisposición genética a desarrollar miocardiopatía hipertrófica.

Campo de la invención

La invención se relaciona con un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar miocardiopatía hipertrófica o para diagnosticar un sujeto de dicha enfermedad, basado en un ensayo genético, extracorpóreo, de una muestra biológica procedente de dicho sujeto, que comprende detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual de un nucleótido, asociada con dicha enfermedad, en el gen MYH7 que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana.

Antecedentes de la invención

La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad autosómica dominante que representa un grupo heterogéneo de enfermedades del músculo cardíaco cuyos síntomas y manifestaciones clínicas incluyen grados variables de hipertrofia y alteración de la función sistólica y diastólica. La MCH puede ser familiar (MCHF) o esporádica (MCHE). Los individuos afectados por dicha enfermedad pueden ser sintomáticos o asintomáticos. La prevalencia es de aproximadamente 1/500 en la población general y la consecuencia más seria es la muerte súbita de los individuos portadores y aparentemente sanos.

La MCHF es una enfermedad hereditaria del músculo cardíaco que se caracteriza por un incremento en la masa ventricular y una alteración de la función sistólica y diastólica. La patología de la MCHF es el resultado de las consecuencias fisiológicas de la alteración de la función sistólica y diastólica, y sus características patológicas están bien establecidas (Marón BJ & Epstein SE. 1980. Amer. J. Cardiol. 45:141-154; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a textbook of cardiovascular medicine. WB Saunders; Philadelphia. p 1404). Además del hallazgo clásico del engrasamiento asimétrico del septo interventricular también puede observarse la hipertrofia de la pared anterior del ventrículo izquierdo y del apex cardíaco. La distribución anatómica y la severidad de la hipertrofia pueden ser muy variables. Con frecuencia se observa fibrosis en el ventrículo hipertrofiado y en la región del septo.

La mayoría de las anormalidades histológicas características de la MCHF tienen que ver con la desorganización de las miofibrillas en los miocitos. Los miocitos pueden hipertrofiarse hasta diez o veinte veces el diámetro normal de una célula cardíaca (Becker AE. 1989. Pathology of Cardiomyopathies, en Cardiomyopathies: Clinical Presentation, Differential Diagnosis, and Management, Shaver JA ed., F. A. Davis Co., New York, pp. 9-31; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a textbook of cardiovascular medicine.WB Saunders; Philadelphia. p 1404).

Actualmente se admite que la MCH es el resultado de mutaciones en genes que codifican las proteínas del aparato contráctil. De hecho, entre las posibles causas de dicha enfermedad, se reconoce la existencia de mutaciones en los siguientes genes: cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana (MYH7); Proteína de unión a la miosina (MYBPC3); Troponina T (TNNT2); Troponina I (TNNI3); Troponina C (TNNC1); Alfa tropomiosina (TPM1), Cadena reguladora ligera de la miosina (MYL2); Cadena ligera esencial de la miosina (MYL3), Actina cardíaca alfa (ACTC) (Richard P et al; 2003 Circulation. 107(17):2227-32); Titina (TTN) (Satoh et al. 1999. Biochem Biophys Res Commun 262, 411); Cadena pesada de la alfa miosina (MYH6) (Tanigawa et al. 1990.) Cell 62,991); Sub-unidad no catalítica gamma 2, activada por AMP, de la proteína kinasa (PRKAG2) (Gollob et al. (2001) N Engl J Med 344, 1823; Blair et al. 2001 Hum Mol Genet 10, 1215); Quinasa 2 de la cadena ligera de la miosina (MYLK2) (Davis et al. 2001 Cell 107, 631); Genoma mitocondrial (Arbustini et al. Heart 1998; 80:548-58).

Diversos análisis genéticos han permitido identificar mutaciones en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociadas a la aparición de MCHF (Seidman CE & Seidman JG. 1991. Mol. Biol. Med. 8:159-166; Tanigawa et al. 1990. Cell 62:991-998; Geisterfer-Lowrance et al. 1990. Cell 61:999-1006), habiéndose identificado más de 100 mutaciones causantes de MCHF (http://www.cardiogenomics.org).

Actualmente el diagnóstico de la MCHF se basa en los datos clínicos, fundamentalmente el ecocardiograma. Sin embargo, este sistema no permite detectar los casos de muerte súbita que, en general, están provocados por la presencia de una mutación en alguno de los genes implicados. Como es conocido, la MCHF es la primera causa de muerte súbita en personas jóvenes y, dada su prevalencia (1/500), puede estimarse que el número de portadores de alguna de las mutaciones responsables de dicha enfermedad en nuestro país se acerca a las 75.000 personas.

El gran tamaño de los genes relacionados hasta la fecha con la aparición de MCH, por ejemplo, el gen MYH7 (28.425 pares de bases) dificulta en gran medida la identificación de mutaciones asociadas con MCH. Esta invención proporciona un método sencillo y rápido para la identificación de algunas mutaciones en el gen MYH7 que pueden ser causa de MCH.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de una nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada con una mayor predisposición de que el sujeto que la porta desarrolle MCH. La nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada con el desarrollo o la predisposición a desarrollar MCH identificada en esta invención es la mutación Ala797Pro, la cual se definirá detalladamente más adelante.

La identificación de la presencia de dicha mutación en el gen MYH7 en un sujeto con MCH permite tomar medidas preventivas en el caso de los portadores, tales como ejercicio, medicación, consejo genético, etc. En los casos en los que se identifiquen mutaciones consideradas de alto riesgo podrán tomarse medidas adicionales tales como la implantación de un desfibrilador con el fin de evitar la muerte súbita del sujeto portador de tales mutaciones.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH que comprende analizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha mutación es Ala797Pro.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico in vitro de MCH que comprende obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia de una mutación puntual en el gen MYH7, en el que dicha mutación es Ala797Pro, como indicador de la enfermedad.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método no invasivo para diagnosticar MCH en un sujeto que comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que comprende, al menos, una de las regiones del gen MYH7 en donde se encuentra la mutación puntual responsable de dicha mutación Ala797Pro, y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia o ausencia de, al menos, dicha mutación, como indicador de la enfermedad.

La invención proporciona, por tanto, un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH, o para diagnosticar un sujeto de MCH, bien sea familiar (MCHF) o esporádica (MCHE), basado en la detección de una nueva mutación puntual en el gen MYH7 relacionada con la aparición de dicha enfermedad. La detección de la mutación en una persona con riesgo o predisposición genética de desarrollar MCH puede realizarse de forma relativamente sencilla y rápida usando el método proporcionado por esta invención.

El método proporcionado por esta invención constituye una herramienta útil de diagnóstico y/o pronóstico que resulta particularmente importante cuando se aplica sobre sujetos asintomáticos de los cuales se sospecha que pueden tener la enfermedad. Los sujetos sintomáticos tienen muchas más probabilidades de ser diagnosticados adecuadamente por un médico. Los sujetos asintomáticos de familias que tengan una historia de MCHF podrían ser diagnosticados usando el método de esta invención lo que permitiría su diagnóstico antes de la...

1. Un método para determinar in vitro la predisposición de un sujeto a desarrollar miocardiopatía hipertrófica (MCH) que comprende analizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Ala797Pro.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho gen MYH7 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho cambio de nucleótidos relacionado con dicha mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, Ala797Pro, sones el siguiente:

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica procedente del sujeto contiene ácido nucleico.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico se selecciona entre DNA y RNA.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica procedente del sujeto se selecciona entre una muestra de tejido y una muestra de sangre de dicho sujeto.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha muestra biológica comprende células nucleadas de sangre periférica del sujeto a ensayar.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende, además, la amplificación de un fragmento del gen MYH7 en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar, en donde dicho fragmento del gen MYH7 a amplificar comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una variante de la misma.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha amplificación se lleva a cabo mediante PCR anidada o nested-PCR.

11. Método según la reivindicación 8, en el que dicha amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de banda, la amplificación basada en la transcripción, la replicación de secuencia auto-sostenida (3SR), el sistema de la replicasa Qβ, la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) o la amplificación por la polimerasa del fago phi29.

12. Método según la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, Ala797Pro, se detecta mediante el empleo de sondas de oligonucleótidos marcadas con un grupo marcador detectable.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH se detecta mediante el empleo de una sonda de nucleótidos fijada sobre un soporte sólido, en donde dicha sonda de nucleótidos se selecciona entre (i) una sonda de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia normal de nucleótidos que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana o a un fragmento de la misma que contiene la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual, y (ii) una sonda de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana mutada o a un fragmento de la misma que contiene la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de mutación puntual, y detectar la presencia o ausencia de hibridación.

14. Método según la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, Ala797Pro, se detecta mediante digestión con enzimas de restricción y análisis de los fragmentos de restricción (RFLP).

15. Método según la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, Ala797Pro, se detecta mediante secuenciación directa de nucleótidos, minisecuenciación directa, ensayos de hibridación en array, ensayos dependientes de discriminación de alelos basada en hibridación, electroforesis en gel diagonal de fragmentos de restricción dispuestos en placas de microtitulación (MADGE) o transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET).

16. Método según la reivindicación 1, en el que la MCH es miocardiopatía hipertrófica familiar (MCHF).

17. Método según la reivindicación 1, en el que la MCH es miocardiopatía hipertrófica esporádica (MCHE).

18. Un método de diagnóstico in vitro de miocardiopatía hipertrófica (MCH) que comprende obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia de una mutación puntual en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Ala797Pro.

19. Un método no invasivo para diagnosticar miocardiopatía hipertrófica (MCH) en un sujeto que comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que comprende, al menos, una de las regiones del gen MYH7 en donde se encuentra una mutación puntual asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Ala797Pro, y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en dicho fragmento de ácido nucleico.

20. Un kit que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de, al menos, una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Ala797Pro.

21. Kit según la reivindicación 20, en el que dicho reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual, es una sonda de oligonucleótidos que permite distinguir el alelo que contiene una G en la posición 14131 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una C en dicha posición.

22. Kit según la reivindicación 20, que comprende, al menos, una enzima de restricción que permite distinguir el alelo que contiene una G en la posición 14131 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una C en dicha posición.

23. Kit según la reivindicación 22, en el que dicha enzima de restricción es la enzima de restricción Cac8I.

24. Kit según la reivindicación 20, que comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la amplificación de un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual.

25. Kit según la reivindicación 24, que comprende un oligonucleótido iniciador seleccionado del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 36, SEQ. ID. NO: 37, y sus mezclas.

26. Un oligonucleótido iniciador seleccionado del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 36, SEQ. ID. NO: 37, y sus mezclas.

27. Un biochip que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de, al menos, una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Ala797Pro, soportado sobre un soporte sólido.

28. Biochip según la reivindicación 27, en el que dicho reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual, es una sonda de oligonucleótidos que permite distinguir el alelo que contiene una G en la posición 14131 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una C en dicha posición.

29. Biochip según la reivindicación 27, que comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la amplificación de un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual.

30. Biochip según la reivindicación 29, en el que dicho oligonucleótido iniciador se selecciona del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 36, SEQ. ID. NO: 37, y sus mezclas.

31. Biochip según la reivindicación 30, que comprende, además, uno o más oligonucleótidos iniciadores seleccionados entre los identificados como SEQ. ID. NO: 1- SEQ. ID. NO: 35, y SEQ. ID. NO: 38- SEQ. ID. NO: 85.