MEJORA DE LA CALIDAD DEL PRODUCTO EN PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFERO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS.

Un procedimiento de cultivo celular para la producción de una molécula de CTLA4 soluble,

que comprende: a) cultivar células CHO que producen una molécula de CTLA4 soluble en cultivo celular en condiciones que permiten la producción de CTLA4; y b) alimentar las células con D-galactosa

La presente invención reivindica prioridad sobre la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/436.050 presentada el 23 de diciembre de 2002, que se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La presente invención se refiere a nuevos métodos y procedimientos para cultivar células de mamífero que producen un producto proteico, preferentemente un producto proteico glicosilado con mayor y mejor contenido en ácido siálico. El rendimiento de los métodos y procedimientos del cultivo celular en sus diversos aspectos tiene como resultado un producto de alta cantidad y calidad, medido mediante el contenido en ácido siálico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

Preferentemente se usan cultivos de células animales, principalmente cultivos de células de mamífero, para la expresión de proteínas glicosiladas producidas de forma recombinante para aplicaciones terapéuticas y/o profilácticas. Los patrones de glicosilación de las glicoproteínas recombinantes son importantes porque las cadenas laterales de oligosacáridos de las glicoproteínas afectan a la función proteica, así como a las interacciones intramoleculares entre las diferentes regiones de una proteína. Dichas interacciones intramoleculares están 15 implicadas en la conformación de la proteína y la estructura terciaria de la glicoproteína. (Véase, por ejemplo, Wittwer y col., 1990, Biochemistry, 29: 4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell BioI., 4:1017-1023; Goochee y col., 1991, Bio/Technol., 9:1347-1355; y R.B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. BioI., 1:750-754). Además, los oligosacáridos pueden funcionar dirigidos a un polipéptido concreto frente a ciertas estructuras basadas en receptores de hidratos de carbono celulares específicos. (M. P. Bevilacqua y coI., 1993, J. Clin. Invest., 91:379-387; 20 R.M. Nelson y coI., 1993, J. Clin. Invest., 91:1157-1166; K.E.Ilorgard y coI., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; y Y. Imai y coI., 1993, Nature, 361-555-557).

Se sabe que el componente de ácido siálico terminal de una cadena lateral de oligosacáridos glicoproteicos tiene un efecto sobre diversos aspectos y propiedades de una glicoproteína, incluidas absorción, solubilidad, estabilidad térmica, semivida en suero, aclaramiento del suero, así como su estructura/comportamiento 25 físico y químico, y su inmunogenicidad. (A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R.B. Parekh, Id., Goochee y coI., Id., J. Paulson y col., 1989, TIBS, 14:272-276; y A. Kobata, 1992, Eur. J. Biochem., 209:483-501; E.Q. Lawson y coI., 1983, Arch. Biochem. Biophys., 220:572-575; y E. Tsuda y coI., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411).

En general, los niveles de expresión proteica en sistemas basados en cultivo de células de mamífero son considerablemente menores que en sistemas de expresión microbiana, por ejemplo sistemas de expresión en 30 bacterias o levaduras. No obstante, las células bacterianas y de levaduras están limitadas en su capacidad para expresar de forma óptima productos proteicos de alto peso molecular, para plegar adecuadamente una proteína que tenga una estructura estérica compleja y/o para proporcionar las modificaciones postraduccionales necesarias para madurar una glicoproteína expresada, de modo que afecta a la inmunogenicidad y tasa de aclaramiento del producto. 35

Como consecuencia de las limitaciones del cultivo de células animales o de mamífero, particularmente de células animales o de mamífero que producen productos recombinantes se ha investigado la manipulación de diversos parámetros, incluidos el empleo de vasos de cultivo a gran escala; alterando las condiciones básicas de cultivo, tales como la temperatura de incubación, la concentración de oxígeno disuelto, el pH y similares; el uso de diferentes tipos de medios y aditivos del medio; e incrementando la densidad de las células cultivadas. Además, el 40 desarrollo de un procedimiento para cultivos de células de mamífero se beneficiaría de los avances en la capacidad de extender los tiempos de ciclo para incrementar la concentración del producto final al tiempo que se mantiene una elevada calidad del producto. Un importante parámetro de la calidad del producto es el grado y finalización de la estructura de glicosilación de un producto polipeptídico, usándose habitualmente el contenido en ácido siálico como medida de la calidad de la glicoproteína. 45

Los tiempos de ciclo de los procedimientos de los cultivos celulares, en particular los procedimientos no continuos, normalmente están limitados mediante la restante viabilidad de las células, que habitualmente disminuye con el tiempo del ciclo. Por tanto, se desea la máxima extensión posible de viabilidades celulares elevadas. Los problemas de la calidad del producto se refiere también ofrecen una motivación para minimizar las disminuciones en la densidad de células viables y mantener una elevada viabilidad celular, ya que la muerte de las células puede 50 liberar sialidasas en el sobrenadante del cultivo, que podrían reducir el contenido en ácido siálico de la proteína

expresada. Los problemas de la purificación de proteínas ofrecen otra motivación más para minimizar las disminuciones de la densidad de células viables y mantener una viabilidad celular elevada. La presencia de restos celulares y el contenido en células muertas en el cultivo pueden afectar de forma negativa a la capacidad de aislar y/o purificar el producto proteico al final del ciclo del cultivo. Manteniendo las células viables durante un mayor periodo de tiempo en cultivo se produce una reducción concomitante de la contaminación del medio de cultivo por 5 las proteínas y enzimas celulares, por ejemplo proteasas y sialidasas celulares, que pueden producir una degradación y, en último término, la reducción de la calidad de la glicoproteína deseada producida por las células.

Se han investigado varios parámetros para conseguir una elevada viabilidad celular en los cultivos celulares. Un parámetro implicó una única disminución de la temperatura del cultivo tras el cultivo inicial a 37ºC (por ejemplo, Roessler y coI., 1996, Enzyme and Microbial Technology, 18:423-427; patentes de EE.UU. nº 5.705.364 y 10 5.721.121 de T. Etcheverry y col., 1998; patente de EE.UU. 5.976.833 de K. Furukawa y col., 1999; la patente de EE.UU. nº 5.851.800 de L. Adamson y col.; el documento WO 99/61650 y el documento WO 00/65070 de Genentech, Inc.; el documento WO 00/36092 de Biogen, Inc.; y la patente de EE.UU. nº 4.357.422 de Girard y col.).

Otros parámetros investigados implicaron la adición de componentes al cultivo. Se ha mostrado que el inhibidor del factor de crecimiento suramina evitaba la apoptosis durante el crecimiento exponencial de las células 15 CHO K1:CycE (Zhangi y coI., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325). No obstante, la suramina no protegía contra la apoptosis durante la fase de muerte. Como resultado, la suramina pudo mantener una viabilidad elevada durante la fase de crecimiento, pero no permitió una extensión de la longevidad del cultivo. Los mismos autores informan que para la línea celular CHO 111-10PF, el sulfato de dextrano y el polivinilsulfato pudieron, de forma similar a la suramina, incrementar el día 3 la densidad de células viables y la viabilidad respecto al cultivo control. No obstante 20 no se notificó el efecto del sulfato de dextrano o del polivinilsulfato durante la fase de muerte. También se informó de que la suramina, el sulfato de dextrano y el polivinilsulfato eran eficaces en la prevención de la agregación celular.

El medio de cultivo de células animales se ha suplementado con heparina con el fin de adaptar las líneas celulares dependientes del anclaje a las condiciones de la suspensión (p. ej., la patente de EE.UU. nº 5,348.877 de 25 McKenna y Granados, 1994). También se sabe que la heparina se une a factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina (HB-EGF; Raab y Klagsbrun, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1333, F179-F199). Se ha notificado que los proteoglucanos de sulfato de heparan de superficie celular (HSPG) potencian la unión de HB-EGF y la bioactividad para ciertos tipos de células, incluidas las células CHO salvajes (Raab and Klagsbrun, 1997). [El sulfato de heparan sólo difiere de la heparina en que tiene menos grupos N-sulfato 30 y O-sulfato y más grupos N-acetilo (McKenna and Granados, 1994). Para los fines de esta divulgación, la heparina y el sulfato de heparán se consideran equivalentes y, de forma genérica, se denominarán heparina.] Se ha propuesto, para el factor de crecimiento de unión...

1. Un procedimiento de cultivo celular para la producción de una molécula de CTLA4 soluble, que comprende:

a) cultivar células CHO que producen una molécula de CTLA4 soluble en cultivo celular en condiciones que permiten la producción de CTLA4; y 5

b) alimentar las células con D-galactosa.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de alimentación b) se produce a diario.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de alimentación b) se produce de forma continua. 10

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la alimentación se produce más de una vez al día.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la alimentación se produce con menor frecuencia que a diario.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células en medio de alimentación son 15 alimentadas con D-galactosa.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el medio de alimentación contiene D-galactosa en una cantidad de aproximadamente 1 a 50 g/l.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el medio de alimentación contiene D-galactosa en una cantidad de aproximadamente 3 a 25 g/l y, preferentemente, en una cantidad de 20 aproximadamente 12,5 g/l.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la D-galactosa se sostiene o mantiene en el cultivo celular a una concentración de aproximadamente 0,1 a 10 g/l.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el cultivo celular es un cultivo celular a gran escala. 25

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el cultivo celular a gran escala es superior a aproximadamente 50 l.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el cultivo celular a gran escala es de 500 l y superior.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se aumenta la 30 sialilación del CTLA4 producido.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la molécula de CTLA4 soluble es una proteína de fusión de CTLA4 soluble.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la molécula de fusión de CTLA4 soluble comprende la secuencia de aminoácidos que comienzan con metionina en la posición + 1 o alanina en la 35 posición -1 y que terminan en el ácido aspártico en la posición 124 como se muestra en la figura 8.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que proteína de fusión de CTLA4 soluble es una CTLA4Ig.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que proteína de fusión de CTLA4 soluble es CTLA4Ig que comprende los aminoácidos -1 a 357 o +1 a 357 como se muestra en la FIG. 8. 40

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que proteína de fusión de CTLA4 soluble está codificada en el ADN depositado en la ATCC con el número de registro en la ATCC 68629.

19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la molécula de CTLA4 soluble es una molécula mutante de CTLA4 soluble.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble comprende la secuencia de aminoácidos que comienza con metionina en la posición + 1 o alanina en la posición -1 y que termina en el ácido aspártico en la posición 124 como se muestra en la figura 9. 5

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble está codificada en el ADN depositado en la ATCC con el número de registro en la ATCC PTA-2104.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble es L104EA29Ylg que comprende los aminoácidos -1 a 357 o +1 a 357 como se muestra en la FIG. 9. 10

23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que además comprende:

c) cultivar las células CHO a una temperatura de o próxima a 37ºC en condiciones y durante un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular;

d) después, cultivar las células a una segunda temperatura de o próxima a 34ºC; y

e) después, cultivar las células a una tercera temperatura de o próxima a 32ºC. 15

24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que además comprende:

c) cultivar las células CHO a una temperatura de o próxima a 37ºC en condiciones y durante un periodo de tiempo que permita el crecimiento celular;

d) cultivar las células CHO a una segunda temperatura de o próxima a 34ºC comenzando aproximadamente el día 6 del cultivo; 20

e) cultivar las células CHO a una tercera temperatura de o próxima a 32ºC comenzando aproximadamente el día 10 del cultivo.

25. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que además comprende:

c) añadir compuesto polianiónico al cultivo celular un tiempo posterior a la inoculación.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24, que además comprende: 25

f) añadir compuesto polianiónico al cultivo celular un tiempo posterior a la inoculación.

27. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26, en el que el compuesto polianiónico es sulfato de dextrano.

28. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que además comprende purificar la molécula de CTLA4 soluble. 30