UNA LINEA CELULAR RECOMBINANTE TIENE UNA SIALIDASA CONSTITUTIVA CUYA EXPRESION FUNCIONAL SE INTERRUMPE POR EJEMPLO POR RECOMBINACION HOMOLOGA O UTILIZANDO RNA ANTI-SENTIDO.

LA SIALIDASA SE PURIFICA A PARTIR DEL FLUIDO DE CULTIVO CELULAR DE CELULAS DE OVARIO DE HAMSTER CHINO. EL DNA QUE CODIFICA LA SIALIDASA SE OBTIENE UTILIZANDO UNA SONDA OLIGONUCLEOTIDICA DISEÑADA UTILIZANDO DATOS DE SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA SIALIDASA, Y EL DNA SE EXPRESA EN CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON EL DNA

Sialidasa recombinante de célula CHO.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a la actividad sialidasa, en particular a líneas celulares recombinantes que tienen actividad sialidasa modificada.

Antecedentes de la invención

Las sialidasas son una familia de enzimas glucohidrolíticos que cortan los residuos de ácido siálico de los componentes oligosacáridos de las glucoproteínas y glucolípidos. Se han estudiado las enzimas virales y bacterianas, por ejemplo las sialidasas de la influenza en particular (Air, G. M. y Laver, W.G. (1989) Proteins: Struct. Func. Genet., 6: 341), aunque las sialidasas de mamífero no se han caracterizado bien. En la mayor parte de los casos, los estudios de sialidasas de mamífero se han reducido a la investigación de las especificidades de sustrato y al análisis de la cinética mediante la utilización de preparaciones parcialmente purificadas, aunque una sialidasa de hígado de rata y músculo se ha purificado hasta su homogeneidad (Miyagi, T. y Tsuiki, S. (1985) J. Biol. Chem., 260:6710). Las sialidasas se ha identificado en varios orgánulos celulares: la membrana plasmática (Schengrund, C., Rosenberg, A. y Repman, M.A. (1976) J. Biol. Chem., 79:555), los lisosomas y el citosol (Tulsiani, D.R.P. y Carubelli, R. (1970) J. Biol. Chem., 245:1821).

Las glucoproteínas se producen a menudo mediante la expresión de genes codificantes en células huésped recombinantes in vitro, que tienen los componentes enzimáticos normales de la maquinaria de glucosilación celular. El ácido siálico en el componente oligosacárido de una glucoproteína está implicado en la mediación del aclaramiento del suero y afecta las propiedades físicas, químicas e inmunogénicas de la molécula proteica. Por ello es importante mantener el contenido de ácido siálico de las glucoproteínas, en particular de aquellas proteínas que se desea utilizar como agentes terapéuticos.

Descripción resumida de la invención

En la presente invención se describe la modificación, en una línea celular recombinante, de la expresión constitutiva de genes que codifican enzimas que están implicadas en la destrucción o producción de las porciones de oligosacáridos de glucoproteínas. En particular, la modificación en la línea celular recombinante puede realizarse de tal manera que asegure que el gen o genes de interés no se expresen de modo funcional. Un gen de particular interés es un gen de sialidasa en una línea celular recombinante, especialmente un gen que codifica para una sialidasa citosólica. Ejemplos de líneas celulares son aquellos derivados de ovarios de hámster chino y de riñones embrionarios humanos.

En la línea celular recombinante, la expresión del gen funcional se puede alterar mediante mutación, adición, o deleción de uno o más nucleótidos. Dicha mutación, adición o deleción puede realizarse mediante cualquiera de los procedimientos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo la recombinación homóloga entre el gen genómico y una secuencia de ácido nucleico diferente pero ampliamente homóloga introducida en las células. El gen se puede delecionar completamente.

Puede suceder que el gen no se exprese de modo funcional debido a la alteración de la función génica por la regulación de su transcripción o traducción, por ejemplo, utilizando ARN antisentido.

La presente invención proporciona una sialidasa sustancialmente homogénea que se puede obtener a partir de fluido de cultivo celular de una línea celular de ovario de hámster chino, o a partir de células huésped recombinantes que son capaces de expresar la sialidasa. Las características de dicha sialidasa se describen y discuten infra.

También se describen anticuerpos que son capaces de unirse a la sialidasa. Dichos anticuerpos son útiles para fines de diagnóstico, tales como la identificación o determinación de sialidasa en una muestra de prueba, para fines terapéuticos, y para la purificación de la sialidasa.

La presente invención también proporciona una sonda de oligonucleótidos que es útil en la obtención de un gen que codifica sialidasa y una secuencia de ácidos nucleicos obtenida mediante un proceso que comprende hibridar la sonda con ácido nucleico en una biblioteca de ADN de mamífero para formar híbridos que se pueden aislar. El ácido nucleico se puede utilizar para la expresión de sialidasa. Se puede modificar de todas las maneras, por ejemplo, mediante mutación, adición o deleción de uno o más nucleótidos, amplificación, separación y ajuste de tamaño.

También se proporciona la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica sialidasa aislado de células de ovarios hámster chino, así como vectores recombinantes y células huésped que comprende ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos. Los vectores y células huésped se pueden utilizar, por ejemplo, para producir la enzima sialidasa recombinante.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden sialidasa en una cantidad eficaz en la eliminación de residuos de ácido siálico de los componentes de oligosacárido de glicoproteínas y glicolípidos en un ser humano u otros mamíferos.

Se puede alterar un gen de sialidasa de una célula de modo que no se exprese funcionalmente, siendo el nivel de sialidasa funcional producido por las células de tal magnitud que los residuos de ácido siálico en las cadenas laterales de carbohidratos de la glicoproteína producida por las células no se cortan, o no se cortan en un grado que afecte a la función de la glicoproteína. Dichas células son útiles como células huésped para la expresión de glicoproteínas recombinantes a partir de ácido nucleico transformado en las células en condiciones apropiadas. Las glicoproteínas producidas mediante la expresión de ácido nucleico codificante introducido en estas células deberían tener intactas y funcionales las cadenas laterales de carbohidrato. Por tanto, las células deficientes en sialidasa son de especial utilidad para la expresión recombinante de proteínas que tengan residuos de ácido siálico que son necesarios para la actividad enzimática, inmunológica, u otra actividad biológica deseadas de la proteína.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Perfil de elución de enfoque cromatográfico de sialidasa de células CHO sobre DEAE Sepharose. La columna se eluyó con Politampón 96 como se describe en Métodos, o=pH de cada fracción. La localización de la enzima se determinó mediante ensayo utilizando 4-MU-Neu5Ac como sustrato O = actividad enzimática. El contenido proteico (?) de cada fracción se determinó mediante análisis colorimétrico.

Figura 2: Gel de poliacrilamida-SDS de la sialidasa de células CHO teñido para proteínas. Carril A: sialidasa de células CHO, 2 µg. Carril B: estándares de peso molecular, fosforilasa b, 97.400; albúmina sérica bovina, 66.200; ovoalbúmina, 45.000; anhidrasa carbónica, 31.000; inhibidor de tripsina de soja, 21.500; y lisozima, 14.400.

Figura 3: Gel de isoelectroenfoque de poliacrilamida de la sialidasa de células CHO. El gel se reveló como se describe en Métodos y se tiñó para proteínas. Carril 1: estándares proteicos; ribonucleasa, pl=9,5; mioglobina de ballena (recombinante), pl=8,3; mioglobina de caballo, pl=7,3; conalbúmina, pl=5,9; albúmina sérica bovina, pl=4,7; amiloglucosidasa pl=3,5. Carril b: sialidasa de CHO purificada, S_a y S_b, un total de 2 µg cargados. Carril C: gel teñido con sustrato fluorogénico. Antes de la tinción de proteínas, el gel se impregnó con 4-MU-Neu5Ac y se incubó a 37ºC. El gel se visualizó con luz ultravioleta con el fin de detectar aquellas bandas con actividad sialidasa.

Figura 4: pH-dependencia de la actividad enzimática. Los ensayos se llevaron a cabo bien con la enzima purificada (puntos rellenos) o bien con los lisados celulares crudos (puntos vacíos) utilizando 4-MU-Neu5Ac como sustrato (ver Métodos). Tampón fosfato: cuadrados. Tampón acetato: triángulos.

Figura 5: Detección del inmunoblot de carbohidratos en sialidasa de células CHO sobre membrana de fluoruro de polivinilideno. La sialidasa (1,5 µg) y la transferrina (0,8 µg) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a la membrana. Carriles A y B: tinción para proteínas de sialidasa y transferrina, respectivamente. Carriles C y D:...

1. Secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una sialidasa obtenible a partir de fluido de cultivo celular de una línea celular de hámster chino, cuya secuencia se obtiene mediante un proceso que comprende: