TRANSPORTADOR DE FUCOSA.

Célula de hámsteres chino DXB11 en la que se destruye un gen transportador de fucosa

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2004/008956.

Solicitante: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 5-1, UKIMA 5-CHOME, KITA-KU TOKYO, 115-8543 JAPON.

Inventor/es: SUGO,IZUMI,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, HABU,KIYOSHI,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, TSUCHIYA,MASAYUKI,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, UENO,KENJU,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, SEKIMORI,YASUO,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, IIJIMA,SHIGEYUKI,C/O CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA.

Fecha de Publicación: 26 de Noviembre de 2010.

Fecha Solicitud PCT: 18 de Junio de 2004.

Fecha Concesión Europea: 21 de Julio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
C12P21/00B

Clasificación PCT:

C12N15/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
C12N15/11 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Clasificación antigua:

C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Fragmento de la descripción:

CAMPO TÉCNICO

En la presente memoria se da a conocer un polipéptido transportador de fucosa, un ADN que codifica el polipéptido transportador de fucosa, una célula con funciones inhibidas de transportador de fucosa y un procedimiento para identificar un compuesto que se une a un transportador de fucosa o un compuesto que inhibe la actividad del transporte de fucosa. Además en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para producir una proteína recombinante y particularmente un anticuerpo que utiliza la célula con funciones inhibidas de transportador de fucosa.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales mediante su actividad de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo) o su actividad de CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Los anticuerpos son glucoproteínas unidas por la cadena de azúcar. Es conocido que una actividad citotóxica del anticuerpo puede variar en función de los tipos y cantidades de cadenas de azúcar que se unen al anticuerpo. En particular, se ha publicado que la cantidad de fucosa que se une a un anticuerpo está muy implicada en la actividad citotóxica (Shields et al., J. Biol. Chem., 277(30), 26733-26740, 2002). Además, se ha publicado un procedimiento para producir un anticuerpo recombinante que no tiene fucosa. Dicho procedimiento implica impedir que una enzima que cataliza el enlace de la fucosa a una cadena de azúcar se exprese en la producción del anticuerpo para obtener un anticuerpo con aumento de actividad citotóxica (publicación de la patente internacional WO 00/61739).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención consiste en aislar un gen del transportador de fucosa o el polipéptido intracelularmente implicado en el transporte de la fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en obtener una célula para producir una proteína extraña con funciones inhibidas de transportador de fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en aislar un compuesto que puede inhibir las funciones de transportador de fucosa. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir de manera fácil y fiable una proteína recombinante en la que el enlace de la fucosa se elimina o disminuye. En particular, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir un anticuerpo en el que el enlace de la fucosa se elimina o disminuye y cuya actividad citotóxica aumenta. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una célula hospedadora para producir dicha proteína.

En un mecanismo mediante el cual la fucosa se une a un anticuerpo en una célula que produce anticuerpos, es sabido que GDP se une a la fucosa que se ha incorporado a una célula. GDP-fucosa se incorpora a continuación al aparato de Golgi y a continuación la fucosa del GDP-fucosa se transfiere a la N-acetilglucosamina, que se ha añadido como una cadena de azúcar a la proteína dentro del aparato de Golgi. Específicamente, la zona Fc de una molécula de anticuerpo tiene dos zonas a las que se une una cadena de azúcar unida a N-glucósido. La fucosa se une a la porción de N-acetilglucosamina de una cadena de azúcar unida a N-glucósido (Pate L. Smith et al., J. Cell. Biol., 2002, 158, 801-815). En el contexto de la presente invención se ha estudiado este mecanismo y se ha deducido que si se puede inhibir la incorporación de GDP-fucosa en el aparato de Golgi, se puede suprimir el enlace de la fucosa a la proteína. Como resultado de estudios exhaustivos que se refieren a una sustancia que incorpora GDP-fucosa en el aparato de Golgi se aisló la sustancia como un transportador de fucosa y se ha descubierto que un anticuerpo al que no se une ninguna fucosa y que presenta aumento de actividad citotóxica puede obtenerse utilizando una célula (con funciones inhibidas de transportador de fucosa) como hospedador para la producción de la proteína recombinante. Por lo tanto, se ha concluido la presente invención.

En la presente invención, para satisfacer las condiciones cuando se inhibe la adición de fucosa a un anticuerpo, no es necesario que todos los anticuerpos producidos no experimenten la adición de fucosa a éstos, sino que la proporción de proteína a la que se ha añadido fucosa disminuiría entre las composiciones del anticuerpo.

La presente invención proporciona una célula, la utilización y el procedimiento tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En las mismas, se dan a conocer:

[1] Un polipéptido recombinante o un fragmento del mismo tal como se muestra en

(a) o (b):

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2; o

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2 por eliminación, sustitución, inserción o adición de 1 o varios aminoácidos y que es funcionalmente equivalente al polipéptido (a).

[2] Un ADN, que codifica el siguiente polipéptido (a) o (b):

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2; o

[3] Un ADN, que comprende el siguiente ADN (c) o (d):

(d) un ADN que se hibrida en condiciones severas a un ADN constituido por una secuencia complementaria al ADN que comprende la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1 y que codifica un polipéptido que es funcionalmente equivalente al polipéptido codificado por el ADN (c).

[4] Un fragmento de ADN que es un fragmento del ADN según [2] o [3] o es un fragmento de un ADN que es complementario al ADN según [2] o [3] y que consta de por lo menos 15 nucleótidos.

[5] Un vector recombinante, que comprende el ADN según [2] o [3].

[6] Un transformado, que comprende el vector recombinante según [5].

[7] Un procedimiento para producir el polipéptido según [1], que comprende cultivar el transformado según [6] y recoger el polipéptido del transformado cultivado del sobrenadante del cultivo del mismo.

[8] Un anticuerpo, que se une al polipéptido según [1].

[9] Un procedimiento de identificación de un compuesto que se une al polipéptido según [1], que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra que va a analizarse con el polipéptido;

(b) detectar la actividad de enlace entre el polipéptido y la muestra que va a analizarse; y

[10] Un compuesto que se une al polipéptido según [1], que puede aislarse por el procedimiento según [9].

[11] Un procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe la actividad de transporte del GDP-fucosa del polipéptido según [1], que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra que va a analizarse y GDP-fucosa con el polipéptido;

(b) detectar la capacidad del polipéptido para incorporar GDP-fucosa; y

[12] Un compuesto que inhibe la actividad del polipéptido para transportador GDPfucosa según [1], que puede aislarse por el procedimiento según [11].

[13] Una célula, que presenta un aparato de Golgi en el que ha disminuido la fucosa.

[14] Una célula, que presenta una capacidad para transportar la fucosa disminuida

o que carece de dicha capacidad.

[15] Una célula que presenta una capacidad disminuida para incorporar la fucosa en un aparato de Golgi o que carece de dicha actividad.

[16] Célula según cualquiera de los apartados [13] a [15], que consiste en un compuesto que se une a un transportador de fucosa o un compuesto que inhibe la actividad de transporte de fucosa.

[17] Una célula en la que la expresión de un transportador de fucosa se suprime artificialmente.

[18] Célula según el apartado [17], en la que la expresión de un transportador de fucosa se suprime utilizando iARN.

[19]...

Reivindicaciones:

Reivindicaciones

1. Célula de hámsteres chino DXB11 en la que se destruye un gen transportador de fucosa.

2. Célula según la reivindicación 1, en la que la célula de hámsteres chino es una célula de CHO.

3. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen se destruye por recombinación homóloga utilizando un vector de reconocimiento génico.

4. Utilización de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir una proteína recombinante.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la proteína recombinante es un anticuerpo.

6. Procedimiento para producir una proteína recombinante utilizando la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como célula hospedadora.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la proteína recombinante es un anticuerpo.

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