Un método para producir una glicoproteína en una célula huésped recombinante,

que comprende permitir la expresión de dicha glicoproteína en un huésped de basidiomiceto provisto con actividad de N-acetilglucosamina: a-3-D-manosida ß-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT-I; CE 2.4.1.101)

Glicoingeniería en setas.

La invención se refiere al campo de la ingeniería genética, más específicamente al campo de la producción de glicoproteínas, más específicamente a la ingeniería del modelo de glicosilación de glicoproteínas.

Las glicoproteínas son proteínas que se han sometido a la llamada modificación post-translacional, en el sentido de que los grupos azúcar están covalentemente acoplados a la proteína. Se encontró que aproximadamente el 50% de las proteínas producidas por una célula viva sufren la glicosilación. Además, parece que el tipo de glicosilación es diferente entre los eucariotas, lo que significa que se usan tipos diferentes de restos de azúcar y/o un orden diferente de unión de los restos a la estructura de la proteína, formándose así una variedad de estructuras de ramificación. La glicosilación de proteínas está muy regulada y cambia durante la diferenciación, el desarrollo, bajo las diferentes condiciones fisiológicas y de cultivo de la célula y en la enfermedad. La glicosilación de proteínas recombinantes, sobre todo aquellas destinadas a una administración potencial a sujetos humanos, tiene una importancia crítica, ya que afecta a muchas propiedades de la (glico)proteína, tales como un plegamiento apropiado, resistencia/sensibilidad de proteasa, tráfico intracelular y compartimentalización, afinidades intermoleculares y reconocimiento de tejidos. La glicosilación afecta además profundamente al período de semivida biológico, la actividad, la función, la solubilidad, el aclaramiento desde la circulación y, crucial para las glicoproteínas farmacéuticas pretendidas, la antigenicidad.

Las células de especies no humanas no glicosilan sus proteínas del mismo modo que lo hacen las células humanas. En muchos casos, las diferencias son profundas. En general, las especies más distantes a los seres humanos en términos evolutivos, tales como bacterias, levaduras, hongos, insectos y plantas - las especies usadas más comúnmente en sistemas de expresión - tienen repertorios de glicosilación menores que el nuestro propio.

Los anticuerpos monoclónicos secretados por sistemas de expresión de células recombinantes u organismos transgénicos casi siempre contienen un sitio de glicosilación único en Asn 297, un sitio localizado en el dominio CH2 dentro de la región Fc de la molécula. Los anticuerpos monoclónicos que carecen del glicano N-unido en el dominio CH2 exhiben una unión de antígeno normal mediada por regiones hipervariables de las partes Fab de la molécula, pero son deficientes en las funciones del efector de Fc, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la lisis mediada por complemento (CDL). Estas y otras funciones del efector requieren el reconocimiento molecular entre el dominio Fc de la molécula IgG y proteínas tales como los receptores de Fc en las superficies de inmunocitos (ADCC) o proteínas solubles que inician la cascada del complemento (CML). La glicosilación es importante para la función efectora del anticuerpo, tal como ADCC y CML, que media la eliminación de células tumorales por anticuerpos desarrollados como oncolíticos.

Muchos sistemas de expresión son hoy día empleados o explorados como plataformas de producción biofarmacéuticas (E. coli, células CHO, células de insecto, plantas, algas, levaduras, hongos filamentosos, etc.). La conveniencia es determinada por muchos parámetros, como por ejemplo seguridad, eficacia, gastos y, por último, por modificaciones post-translacionales que, o bien, son requeridas, o bien, tienen que estar ausentes.

Están siendo explorados sistemas de expresión de levadura, y Pichia pastoris, en particular, como potenciales plataformas de producción para agentes biofarmacéuticos con requerimientos especiales en cuanto a la N-glicosilación. Como se discute anteriormente, la composición actual de esta modificación post-translacional es esencial para ciertos enfoques terapéuticos que implican anticuerpos monoclónicos, sobre todo aquellos que requieren la acción del sistema inmunológico del paciente. Para este fin, tuvieron que ser establecidos cambios fundamentales en la ruta de N-glicosilación de esta levadura.

Aún queda la necesidad de un sistema que proporcione una glicosilación "tipo humana" con eficacia, de bajo coste y alto rendimiento.

Resumen de la invención

Los presentes inventores observaron que varios basidiomicetos carecen de N-glicanos hipermanosilados o complejos y que contienen principalmente N-glicanos con alto contenido en manosa en el intervalo de Man9 hasta Man5. Se encontró que la mera introducción de una actividad de GnT-I heteróloga, sin ninguna interferencia adicional con la ruta de N-glicosilación, permite la síntesis de la estructura híbrida GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂ (también denominada GnM5) en basidiomicetos. Esta estructura híbrida puede ser modificada después in vivo o in vitro para obtener una glicoproteína recombinante con un modelo de N-glicosilación tipo mamífero.

Descripción de las figuras

Figura 1. Espectros de masa MALDI-TOF de aductos (M + Na)⁺ de N-glicanos de carpóforos del tipo silvestre de S. commune (panel A) y la línea transgénica Sc2 (panel B) transformada con el gen de GnT-I humano. La flecha indica el ión correspondiente a GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂ en m/z 1460,5.

Figura 2. Un detalle de espectros de masa MALDI-TOF mostrados en la Figura 1. S. commune tipo silvestre (panel A) y la línea transgénica Sc2 transformada con el gen de GnT-I humano (panel B). La flecha indica el ión correspondiente a GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂ en m/z 1460,5.

Figura 3. Espectros de masa MALDI-TOF de aductos de (M + Na)⁺ de N-glicanos de carpóforos de S. commune tipo silvestre (panel A) y la línea transgénica Scl2 (panel B) transformada con el gen de GnT-I humano. La flecha indica el ión correspondiente a GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂ en m/z 1460,5.

Figura 4. Un detalle de espectros de masa MALDI-TOF mostrados en la Figura 3. S. commune tipo silvestre (panel A) y la línea transgénica Sc2 transformada con el gen de GnT-I humano (panel B). La flecha indica el ión correspondiente a GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂ en m/z 1460,5.

Figura 5. Transferencia Northern del ARN total purificado de micelios de ocho transformantes de S. commune que contienen el gen de hGnT-I usando un fragmento de este gen como sonda. La banda indicada por la flecha representa el transcrito de GnT-I.

Figura 6. Secuencia de nucleótidos de un fragmento de SalI/EcoRI que comprende el promotor de gpd de Schizophyllum commerce, el cDNA que codifica el GnT-I humano y una secuencia de terminación.

Descripción detallada de la invención

El modelo de glicosilación de proteínas humanas difiere de las glicosilaciones que pueden observarse en proteínas expresadas en sistemas de expresión de proteínas eucarióticos usados a menudo, tales como levaduras, plantas y células mamíferas (para una revisión, véase, por ejemplo, Spiro (2002), Glycobiology, Volumen 12, Nº. 4, pp. 43R-56R).

Las bacterias, sobre todo la mayor parte usadas a gran escala para la producción de proteínas recombinantes, tienen la desventaja de que no glicosilan las proteínas recombinantemente expresadas.

Como es de esperar, la glicosilación en sistemas de expresión de células de mamíferos es la que más se parece a la glicosilación humana. Sin embargo, las líneas de células de mamíferos que son capaces de reproducir el procesamiento de glicoproteínas tipo humano tienen varios inconvenientes incluyendo bajos títulos de proteínas, tiempos de fermentación largos, productos heterogéneos y cuestiones de contención viral continua. Por ejemplo, parece que las células CHO, que son genéticamente modificadas para producir grandes cantidades de una proteína específica, no mantienen a menudo el nivel apropiado de glicosilación. Esto causa bajos rendimientos del producto utilizable, lo que contribuye al coste y a la complejidad de producir estas glicoproteínas.

La glicosilación en plantas ha sido propuesta como una alternativa, pero lograr los modelos de glicosilación deseados es todavía un problema con estos sistemas y es una barrera significativa para su adopción extendida para proteínas industriales.

Las levaduras y los hongos filamentosos son organismos de fermentación industrial robustos que pueden ser...

1. Un método para producir una glicoproteína en una célula huésped recombinante, que comprende permitir la expresión de dicha glicoproteína en un huésped de basidiomiceto provisto con actividad de N-acetilglucosamina: a-3-D-manosida ß-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnT-I; CE 2.4.1.101).

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho basidiomiceto se selecciona a partir del grupo que consiste en Agaricus arvensis, Agaricus bisporus, Agaricus blazei, Agrocybe aegerita, Coprinus cinereus, Lentinus edodes, Lepista nuda, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium, Schizophyllum commune, Hypsizygus tessulatus, Pholiota nameko, Boletus edulis, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Volvariella volvacea, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Tremella fuciformis, Auricularia auricular, Lyophyllum descastes, Naemataloma sublaterium, Stropharia rugoso-annulata y Cordyceps sinense.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicho basidiomiceto no tiene esporas.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho basidiomiceto se proporciona con un gen mamífero que codifica la actividad de GnT-I.

5. El método según la reivindicación 4, en el que el gen mamífero es un gen humano.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha glicoproteína es una proteína heteróloga.

7. El método según la reivindicación 6, en el que dicha glicoproteína es una hormona, un anticuerpo, una citoquina o una enzima.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la modificación adicional de dicha glicoproteína con al menos una transferasa y/o una manosidasa.

9. El método según la reivindicación 8, en el que dicha al menos una transferasa y/o manosidasa se selecciona entre el grupo que consiste en GlcNAc-transferasa II, III, IV, V, VI, a-manosidasa II, a-manosidasa III, galactosiltransferasa, sialiltransferasa.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las etapas de modificación adicionales se realiza intracelularmente en dicho basidiomiceto.

11. El método según la reivindicación 9 ó 10, en el que al menos una de las etapas de modificación adicionales se realiza in vitro.

12. El método para expresar una enzima GnT-1 heteróloga en un basidiomiceto, que comprende proporcionar dicho basidiomiceto con un constructo de ácido nucleico que codifica dicha enzima y permite la expresión de dichos constructos en dicho basidiomiceto.

13. El constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia del promotor que permite la expresión en un basiodiomiceto, preferiblemente un promotor de gpd, que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la actividad de GnT-1, y que comprende opcionalmente además una secuencia de terminación de la transcripción.

14. El ácido nucleico según la reivindicación 13, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la actividad de GnT-1 es el gen humano de GnT-1.

15. Una célula huésped de basidiomiceto recombinante que comprende la actividad de GnT-I.

16. Una célula huésped de basidiomiceto recombinante según la reivindicación 15 que expresa a la GnT-1 humana.

17. La célula huésped de basidiomiceto que comprende un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 13 ó 14.

18. El uso de un basidiomiceto que comprende actividad de GnT-I como un huésped para la producción de una proteína mamífera N-glicosilada heteróloga.

19. El uso según la reivindicación 18, en el que dicho basidiomiceto expresa a la GnT-1 humana.

20. El uso según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicho basidiomiceto comprende una célula huésped de basidiomiceto según la reivindicación 15 ó 16.