Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de N. meningitidis de serogrupo A que comprende la etapa de determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a una cepa de referencia de serogrupo A de N.

meningitidis que tiene las siguientes características: b) el % de seropositividad frente a la cepa en un grupo de al menos 25 niños de 1-2 años de edad sin tratar en los que se mide la seropositividad mediante un ensayo de ABSc con títulos de 8 o superiores (para conseguir la destrucción celular del 50%) es menor de aquel del % de seropositividad frente a la cepa convencional F8238 en la que el ABS se realiza diluyendo muestras de suero con un diluyente de ensayo que es PBS que contiene glucosa al 0,1%, MgCl2 0,5 mM y CaCl2 0,9 mM, pH 7,4, añadiendo una dilución de 1:175000 en el diluyente de ensayo de la cepa de referencia diluida a partir de una DO de 0,380-0,420 a 600 nm, añadiendo complemento de conejo bebé para producir una mezcla que corresponde al 50% del complemento y 50% de suspensión bacteriana 1:175000 e incubando durante 1 hora 30 minutos a 37ºC; y c) la cepa de referencia de serogrupo A de N. meningitidis es 3125 aislada

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacuna de neiseria y procedimientos para evaluar la calidad de la respuesta inmune provocada después de su administración, por ejemplo equivalentes de protección de laboratorio y en particular actividad bactericida del suero (ABS).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasivas graves (a una escala endémica y epidémica) tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas, estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La bacteria afecta principalmente a niños de 6 meses a 2 años, pero también afecta a adolescentes. La bacteria se clasifica comúnmente de acuerdo con el serogrupo de su polisacárido capsular.

La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B y su incidencia varía de 1-10/100.000/año de la población total -alcanzando algunas veces valores más elevados (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, HA., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E. y col. Epidemol. Infect. 105: 119-126, 1990).

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, la mayoría en África Central, algunas veces alcanzan niveles de incidencia de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-524, 1989). Casi todos los casos de enfermedad meningocócica como un todo son causados por meningococos de serogrupo A, B, C, W-135 e Y y está disponible una vacuna de polisacárido capsular tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand.

10: 335-339, 1982). Las vacunas de polisacárido disponibles se están mejorando actualmente por medio de la conjugación química de las mismas a proteínas transportadoras (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996). Se ha observado que el polisacárido capsular de serogrupo B es no inmunogénico -más probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentes de huésped (Syle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L, y col. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983).

La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado en las últimas décadas en muchos países europeos. Esto se ha atribuido a la transmisión aumentada debido a un aumento en las actividades sociales en condiciones de hacinamiento (por ejemplo, discotecas, piscinas, teatros, etc.). Ya no es poco común aislar cepas de Neisseria meningitidis que son menos sensibles o resistentes a algunos de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y exige nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármaco y ensayos de diagnóstico para este organismo.

El desarrollo de vacunas eficaces requiere ensayos fiables para establecer si se ha provocado una respuesta inmune eficaz en individuos vacunados. Para las vacunas de serogrupo A, B y C de N. meningitidis los ensayos de Actividad Bactericida del Suero (ABS) se han considerado el patrón oro en el campo (aceptándose un aumento de cuatro veces en ABS como sustitutos para la protección de estos serogrupos) [Borrow y col., 2001, Infect Immun 69: 1568-1573; Vermont y col., 2002, FEMS Immum and Med Microbiol 34: 89-96]. El ensayo puede proporcionar información acerca de: a) si cualquier muestra de suero particular tiene un nivel (título) de anticuerpos bactericidas suficientes para alcanzar un umbral protector, b) un % de seropositividad (%SP) de sujetos que sobrepasan este nivel, c) un % de seroconversión (%SC) de sujetos i) con una proporción de títulos de ABS (títulos séricos de post-a preinmunización) que aumenta más allá de un múltiplo particular (4 veces) o ii) con relación al % de SP si el nivel de títulos de ABS antes de la inmunización en los sujetos (es decir, los muy jóvenes) está por debajo del umbral de ABS protector. Por lo tanto, este ensayo se usa como una primera lectura (de protección y eficacia de la vacuna). Además de los ensayos de ABS con frecuencia se usan ensayos de ELISA de IgG como una lectura secundaria. Estos ensayos de ELISA miden la concentración (en µg/ml) de anticuerpos de IgG en una muestra de suero que se unen a un polisacárido capsular meningocócico (A, C, W-135 o Y).

En ensayos de ABS de A, C, W-135 (o W) e Y el efecto de anticuerpos anti-Neisseria meningitidis de serogrupo A, C, W e Y específicos respectivamente se evalúan en la presencia de complemento (típicamente a partir de conejo bebé [un ensayo de ABSc] o como alternativa a partir de suero humano [un ensayo de ABSh]). Se añade una mezcla de bacterias y complemento a los sueros. Los anticuerpos específicos meningocócicos se unen a la superficie de la célula diana a través de una proteína específica meningocócica o restos de carbohidrato. La subunidad Clq de C1 se une a la porción Fc de la Ig unida a superficie. La unión de C1q a Ig activa la ruta clásica del complemento que en última instancia da como resultado la destrucción de la célula diana. El título bactericida para cada suero se expresa como la dilución sérica recíproca correspondiente a la destrucción del 50%.

En la técnica se conocen bien los procedimientos de ensayo de ABS. En 1976 el Comité de Expertos de la OMS en Patrones Biológicos recomendó que se usara un ensayo de ABS para satisfacer los requerimientos de producción y liberación de vacunas de polisacárido meningocócicas (WHO Tech. Rep. Ser. 1976, 594: 72-73). Desde esta época los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), Atlanta, Georgia, EE.UU. han investigado las diversas variables en un ensayo de ABS (Nº de UFC por pocillo, tampón de ensayo, crecimiento de la cepa diana, tiempo de incubación del ensayo, fuente de complemento, concentración de complemento y dilución de partida del suero) y han recomendado y usado en el campo protocolos de ensayo de ABS convencionales bien conocidos (Maslanka y col. Clin. Diag. Laboratory Immun. 1997, 4: 156-167). Típicamente, los CDC también recomiendan y proporcionan cepas meningocócicas para uso en ensayos de ABS en el campo de vacunas meningocócicas. Por ejemplo, se ha llegado a un consenso (directrices de OMS) para un ensayo de ABS de serogrupo C (MenC) de N. meningitidis con respecto a la cepa de ensayo recomendada para el uso.

Maslanka, S. E. y col. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4(2): 156-167, 1997 describen el uso de diversas cepas de serogrupo A de N. meningitidis de los inmunotipos L10 y L8, L10 en ensayos bactericidas del suero. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Como se ha indicado anteriormente el ensayo de ABS es el procedimiento más importante para medir la actividad funcional de anticuerpos séricos frente a meningococo. Para determinar si un sujeto o una población es seropositiva frente a meningococo invasivo (o se ha seroconvertido después de la vacunación) el ensayo de ABS debe de forma ideal ser tanto sensible como específico. Debe ser sensible a anticuerpos protectores inducidos después de la inmunización con vacunas eficaces (tales como vacunas de conjugado de sacárido capsular MenA/W/C/Y) pero no solamente a complemento que no esté en presencia de anticuerpos. También debe ser específico para que registre la presencia de anticuerpos funcionales frente a cepas invasivas, pero minimice el efecto de la presencia de cualquier anticuerpo de avidez baja que pueda ser eficaz frente a cepas portadoras pero no frente a cepas invasivas.

Los presentes inventores han descubierto que los procedimientos de ABS empleados actualmente para evaluar los anticuerpos protectores frente a serogrupos A y W135 meningocócicos se pueden mejorar significativamente en uno o más de los aspectos anteriores.

Para el serogrupo A (MenA) de N. meningitidis se recomienda una cepa de CDC particular para los ensayos de ABS (F8238) -véase Maslanka y col., mencionado anteriormente. Sin embargo, los inventores han descubierto en un ensayo clínico que aunque los ensayos de ABS que emplean esta cepa pueden determinar la respuesta inmune protectora provocada por la vacunación (con una vacuna conjugada de sacárido capsular MenA) a aproximadamente...

1. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de N. meningitidis de serogrupo A que comprende la etapa de determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a una cepa de referencia de serogrupo A de N. meningitidis que tiene las siguientes características:

b) el % de seropositividad frente a la cepa en un grupo de al menos 25 niños de 1-2 años de edad sin tratar en los que se mide la seropositividad mediante un ensayo de ABSc con títulos de 8 o superiores (para conseguir la destrucción celular del 50%) es menor de aquel del % de seropositividad frente a la cepa convencional F8238 en la que el ABS se realiza diluyendo muestras de suero con un diluyente de ensayo que es PBS que contiene glucosa al 0,1%, MgCl2 0,5 mM y CaCl2 0,9 mM, pH 7,4, añadiendo una dilución de 1:175000 en el diluyente de ensayo de la cepa de referencia diluida a partir de una DO de 0,380-0,420 a 600 nm, añadiendo complemento de conejo bebé para producir una mezcla que corresponde al 50% del complemento y 50% de suspensión bacteriana 1:175000 e incubando durante 1 hora 30 minutos a 37ºC; y c) la cepa de referencia de serogrupo A de N. meningitidis es 3125 aislada.

2. El ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de serogrupo A de N. meningitidis de la reivindicación 1 en el que en la característica b) los al menos 25 niños de 1-2 años de edad sin tratar son nativos de Filipinas.

3. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de serogrupo A de N. meningitidis de las reivindicaciones 1-2, en el que la muestra de suero se ha tomado de un huésped inmunizado con una composición de vacuna que comprende un antígeno sacárido capsular (preferiblemente conjugado con una proteína transportadora) de N. meningitidis de serogrupo A y/o W.

4. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) de serogrupo A de N. meningitidis de las reivindicaciones 1-3, en el que la muestra de suero se ha tomando de un ser humano de 0-55 años de edad, 1 mes-20 años, 2 meses-16 años, 6 meses-10 años, 8 meses-7 años, 10 meses-4 años, 0-2 años, 6 meses-2 o 1-2 años.

5. El uso de un aislado de 3125 de serogrupo A de N. meningitidis en un ensayo de ABS.

6. El uso de un aislado de 3048 de N. meningitidis en un ensayo de ABS.

7. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 1-4 que es un ensayo de ABSh.

8. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 1-4 que es un ensayo de ABSc.