Uso de una composición que comprende una población de células,

población que comprende células que contienen un sustrato de toxina clostridial exógeno que puede ser localizado en la membrana plasmática de dichas células; en el que dichas células son capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial posibilitando el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato, y engloba la unión de una toxina clostridial con un receptor de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el citoplasma y la modificación de la diana enzimática de un sustrato toxina clostridial; en el que las células capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial son células que expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad endógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; o expresan una combinación de receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad endógenos y receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; en el que dicho sustrato de toxina clostridial exógeno consiste en un miembro fluorescente, en el que dicho miembro fluorescente es un péptido que bien puede absorber inherentemente energía luminosa de una cierta longitud de onda y emitir energía luminosa de una longitud de onda diferente o que forma parte de un complejo que absorbe energía luminosa de una cierta longitud de onda y emite energía luminosa de una longitud de onda diferente; un dominio de dirección a la membrana que dirige el sustrato a la membrana celular; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión que es un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento para la proteolisis detectable en el enlace escindible por parte de una toxina clostridial, en la que el sitio de escisión se encuentra entre dicho miembro fluorescente y dicho dominio de dirección a la membrana; en el que más del 50% de dicha población de células comprende dichas células que contienen dicho sustrato de toxina clostridial exógeno para la determinación de la actividad de una toxina clostridial

Análisis de la actividad de una toxina clostridial.

La presente solicitud de patente reivindica prioridad conforme a 35 U.S.C. NAK119(e) respecto de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 60/668.909 presentada el 5 de abril de 2005.

Todos los listados de secuencias del GeneBank citados en la presente solicitud, identificados por sus números de acceso del GenBank, se encuentran disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (EE.UU.), y están todos ellos incorporados por la presente por referencia en su totalidad.

Las propiedades miorrelajantes de las toxinas clostridiales (CoNT) se están explotando en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, p. ej., William J. Lipham, "COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN" (Slack, Inc., 2004). Por ejemplo, se han propuesto terapias con CoNT para tratar la distonía, véase, p. ej., Kei Roger Aoki, et al., "Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G", patente estadounidense n.º 6.319.505 (20 de noviembre de 2001); el dolor, véase, p. ej., Kei Roger Aoki, et al., "Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin", patente estadounidense n.º 6.464.986 (15 de octubre de 2002); las lesiones musculares, véase, p. ej., Gregory F. Brooks, "Methods for Treating Muscle Injuries", patente estadounidense n.º 6.423.319 (23 de julio de 2002); las enfermedades cardiovasculares, véase, p. ej., Gregory F. Brooks, "Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins", publicación de patente estadounidense n.º 2003/0185860 (2 de octubre de 2003); los trastornos neurosiquiátricos, véase, p. ej., Steven Donovan, "Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders", publicación de patente estadounidense n.º 2003/0211121 (13 de noviembre de 2003); el dolor en la parte inferior de la espalda, véase, p. ej., Kei Roger Aoki, et al., "Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain", publicación de patente estadounidense n.º 2004/0037852 (26 de febrero de 2004); así como otros trastornos neuromusculares, véase, p. ej., Kei Roger Aoki, et al., "Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Condition", publicación de patente estadounidense n.º 2001/0021695 (13 de septiembre de 2001); Kei Roger Aoki, et al., "Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum", publicación de patente estadounidense n.º 2002/0010138 (24 de enero de 2002); Kei Roger Aoki, et al., "Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain", publicación de patente estadounidense n.º 2004/0013692 (22 de enero de 2004), estando todas ellas incorporadas en la presente memoria por referencia. Otros usos adicionales propuestos de las CoNT como neuromoduladores biofarmacéuticos se han extendido hasta cubrir una amplia variedad de tratamientos dirigidos a ciertos trastornos que carecen de una base neuromuscular. Por ejemplo, los efectos sobre el sistema nervioso autónomo han permitido el desarrollo de una terapia con toxina botulínica de serotipo A (BoNT/A) para tratar la sudoración o hiperhidrosis axilar, y los informes indican que la BoNT/A puede ser un tratamiento eficaz para el dolor y la tensión miofascial, la apoplejía, la lesión cerebral traumática, la parálisis cerebral, los trastornos de movilidad gastrointestinal, la incontinencia urinaria, el cáncer y el dolor de cabeza de migraña. Por último, las aplicaciones cosméticas y otras aplicaciones terapéuticas son ampliamente conocidas. De hecho, se prevé que el uso esperado de las CoNT, tanto en tratamientos terapéuticos como cosméticos de los seres humanos, se expanda a una selección incluso mayor de enfermedades y de alimentos que puedan beneficiarse de las propiedades miorrelajantes de estas toxinas.

El creciente uso clínico y terapéutico de las toxinas clostridiales necesita que la industria farmacéutica use análisis precisos de la actividad de las toxinas clostridiales para, por ejemplo, garantizar formulaciones farmacéuticas exactas y controlar los estándares de control de calidad establecidos. Además, debido al posible peligro asociado a pequeñas cantidades de toxinas clostridiales en productos alimentarios, la industria alimentaria requiere análisis de toxinas clostridiales, por ejemplo, para validar nuevos procedimientos de envasado de alimentos y para garantizar la seguridad alimentaria. El documento WO 2004/029576 revela un procedimiento para determinar la actividad de una toxina clostridial mediante la puesta en contacto de una célula que contiene un sustrato de la SNARE SNAP-25 fusionado con un fluoróforo con una toxina clostridial; en este documento, se describe un sustrato básico de baja FRET y requiere absolutamente dos fluoróforos para funcionar. A partir del documento WO 2004/031355, se conoce un análisis basado en células para analizar la actividad de las toxinas botulínicas usando células que comprenden una proteína de fusión SNAP-25-YFP como sustrato. El problema de este documento fue la identificación de un inhibidor catalítico botulínico de relevancia clínica que penetrara en el sitio intracelular de acción de la toxina y no fuera tóxico para las células vivas. El documento US 2004/219619, Verderio C. et al., Neuron, Vol. 41, 19 de febrero de 2004, páginas 599-610, revela diversas variantes de la SNAP-25 marcadas con GFP similares a las de Criado M. et al., PNAS, Vol. 96, junio de 1999, páginas 7256 a 7261 y Gonelle-Gispert C., Vol. 113, 22 de agosto 2000, páginas 3197 a 3205, Journal of Cell Science, 113; ninguno de estos documentos se refiere al uso específico destinado a determinar la actividad de una toxina clostridial. El documento US 2004/219619, Fernandez-Salas Ester, 4 de noviembre de 2004, pertenece, en general, a un procedimiento para identificar compuestos que tienen una influencia sobre la actividad de las toxinas. La presente invención proporciona un procedimiento y un uso para determinar la presencia o la actividad de una toxina clostridial útil para diversas industrias, tales como, p. ej., las industrias farmacéuticas y alimentarias, y proporciona también ventajas relacionadas.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra un esquema del paradigma actual del mecanismo de intoxicación por la actividad de las toxinas tetánica y botulínica de una neurona central y periférica. El proceso de intoxicación se puede describir como aquél que comprende cuatro etapas: 1) unión a un receptor, en la que la toxina clostridial se une a un sistema receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) interiorización del complejo, en la que tras la unión de la toxina, una vesícula que contiene un complejo de toxina/sistema receptor es sometida a endocitosis dentro de la célula; 3) translocación de la cadena ligera, en la que se cree que tienen lugar múltiples hechos, incluyendo cambios en el pH interno de la vesícula, formación de un poro en el canal que comprende el dominio H_N de la cadena pesada de la toxina clostridial, separación de la cadena ligera y la cadena pesada de la toxina clostridial, activación enzimática de la cadena ligera; y liberación de la cadena ligera activada y 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera activada de la toxina clostridial escinde proteolíticamente sus sustratos de SNARE diana, tales como, p. ej., SNAP-25, VAMP o sintaxina.

La Fig. 2 muestra un esquema de las proteínas SNARE. La Figura 1a muestra la organización general de los dominios de la SNAP-25, VAMP y sintaxina que representa las ubicaciones aproximadas de las regiones α-helicoidales (recuadros blancos), los motivos de las SNARE (recuadros sombreados con indicaciones S1, S2, S3, S4, V1, V2, X1 o X2) y los dominios de anclaje a la membrana (recuadros blancos indicados con AM). La Figura 1b muestra la organización helicoidal de un motivo de una SNARE.

La Fig. 3 muestra un esquema de la localización subcelular y los sitios de escisión de la SNAP-25, VAMP y sintaxina. La VAMP se localiza en la membrana de la vesícula sináptica, mientras que la SNAP-25 y la sintaxina se localizan en la membrana plasmática. La BoNT/A y la BoNT/E escinden a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo, liberando nueve o 26 residuos, respectivamente. La BoNT/B, la BoNT/D, la BoNT/F, la BoNT/G y la TeNT actúan sobre la parte central conservada de la VAMP (recuadro blanco) y liberan la mitad citosólica amino-terminal de la VAMP en el citosol. La BoNT/C1 escinde a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo, así como escinde a la sintaxina en...

1. Uso de una composición que comprende una población de células, población que comprende células que contienen un sustrato de toxina clostridial exógeno que puede ser localizado en la membrana plasmática de dichas células;

en el que dichas células son capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial posibilitando el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato, y engloba la unión de una toxina clostridial con un receptor de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el citoplasma y la modificación de la diana enzimática de un sustrato toxina clostridial;

en el que las células capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial son células que expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad endógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; o expresan una combinación de receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad endógenos y receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial;

en el que dicho sustrato de toxina clostridial exógeno consiste en un miembro fluorescente, en el que dicho miembro fluorescente es un péptido que bien puede absorber inherentemente energía luminosa de una cierta longitud de onda y emitir energía luminosa de una longitud de onda diferente o que forma parte de un complejo que absorbe energía luminosa de una cierta longitud de onda y emite energía luminosa de una longitud de onda diferente; un dominio de dirección a la membrana que dirige el sustrato a la membrana celular; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión que es un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento para la proteolisis detectable en el enlace escindible por parte de una toxina clostridial, en la que el sitio de escisión se encuentra entre dicho miembro fluorescente y dicho dominio de dirección a la membrana;

en el que más del 50% de dicha población de células comprende dichas células que contienen dicho sustrato de toxina clostridial exógeno para la determinación de la actividad de una toxina clostridial.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dichas células contienen transitoriamente dicho sustrato de toxina clostridial exógeno o dichas células contienen establemente dicho sustrato de toxina clostridial exógeno.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho miembro fluorescente es una proteína fluorescente o una proteína de unión a un fluoróforo.

4. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho dominio de dirección a la membrana comprende una región de bucle interhelicoidal de la SNAP-25, un motivo de aminoácidos QPXRV, en el que X es cualquier aminoácido, una región de hélice α amino-terminal de la SNAP-25 o una región de hélice α carboxi-terminal de la SNAP-25.

5. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha región de bucle interhelicoidal de la SNAP-25 comprende, al menos, 5 residuos de los aminoácidos 85-120 de la SEC ID N.º 1.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que dicha región de bucle interhelicoidal de la SNAP-25 comprende, como máximo, 35 residuos de los aminoácidos 85-120 de la SEC ID N.º 1.

7. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha región de bucle interhelicoidal de la SNAP-25 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N.º 128, SEC ID N.º 129, SEC ID N.º 130, SEC ID N.º 131, SEC ID N.º 132, SEC ID N.º 133 y SEC ID N.º 134.

8. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho motivo de aminoácidos QPXRV comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N.º 135, SEC ID N.º 136, SEC ID N.º 137, SEC ID N.º 138, SEC ID N.º 139, SEC ID N.º 140, SEC ID N.º 141 y SEC ID N.º 142.

9. El uso según la reivindicación 4, en el que dicha región de hélice α amino-terminal de la SNAP-25 comprende, al menos, 5 residuos de los aminoácidos 1-84 de la SEC ID N.º 1 o, como máximo, 80 residuos de los aminoácidos 1-84 de la SEC ID N.º 1.

10. El uso según la reivindicación 4, en el que dicha región de hélice α carboxi-terminal de la SNAP-25 comprende, al menos, 5 residuos de los aminoácidos 121-206 de la SEC ID N.º 1 o, como máximo, 85 residuos de los aminoácidos 121-206 de la SEC ID N.º 1.

11. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato comprende una secuencia de reconocimiento de una toxina clostridial seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que incluye un sitio de escisión, una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que incluye un sitio de escisión, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C que incluye un sitio de escisión, una secuencia de reconocimiento de BoNT/D que incluye un sitio de escisión, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E que incluye un sitio de escisión, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G que incluye un sitio de escisión y una secuencia de reconocimiento de TeNT que incluye un sitio de escisión.

12. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de reconocimiento de toxina clostridial comprende, al menos, seis residuos consecutivos de la SNAP-25, seis residuos consecutivos que comprenden Gln-Arg; al menos, seis residuos consecutivos de la VAMP, seis residuos consecutivos que comprenden Gln-Phe; al menos, seis residuos consecutivos de la SNAP-25, seis residuos consecutivos que comprenden Arg-Ala; al menos, seis residuos consecutivos de la sintaxina, seis residuos consecutivos que comprenden Lys-Ala; al menos, seis residuos consecutivos de la VAMP, seis residuos consecutivos que comprenden Lys-Leu; al menos, seis residuos consecutivos de la SNAP-25, seis residuos consecutivos que comprenden Arg-Ile; al menos, seis residuos consecutivos de la VAMP, seis residuos consecutivos que comprenden Gln-Lys; o, al menos, seis residuos consecutivos de la VAMP, seis residuos consecutivos que comprenden Ala-Ala.

13. Un procedimiento para determinar la actividad de una toxina clostridial, procedimiento que comprende las etapas de:

a. poner en contacto una población de células con una muestra, población que comprende células que son capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial posibilitando el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato, y engloba la unión de una toxina clostridial con un receptor de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el citoplasma y la modificación de la diana enzimática de un sustrato toxina clostridial;

en el que las células capaces de permitir una intoxicación por una toxina clostridial son células que expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad endógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; expresan uno o más receptores de toxina clostridial de baja o de alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial; o expresan una combinación de receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad endógenos y receptores de toxina clostridial de baja o alta afinidad exógenos para uno o más serotipos de toxina clostridial;

en el que dicho sustrato de toxina clostridial exógeno comprende un miembro fluorescente, en el que dicho miembro fluorescente es un péptido que bien puede absorber inherentemente energía luminosa de una cierta longitud de onda y emitir energía luminosa de una longitud de onda diferente o que forma parte de un complejo que absorbe energía luminosa de una cierta longitud de onda y emite energía luminosa de una longitud de onda diferente; un dominio de dirección a la membrana que dirige el sustrato a la membrana celular y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión que es un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento para la proteolisis detectable en el enlace escindible por parte de una toxina clostridial, en la que el sitio de escisión se encuentra entre dicho miembro fluorescente y dicho dominio de dirección a la membrana; y

en el que más del 50% de dicha población de células comprende dichas células que contienen dicho sustrato de toxina clostridial exógeno para la determinación de la actividad de una toxina clostridial;

b. excitar dicho miembro fluorescente; y

c. determinar la fluorescencia de dicha población de célula puesta en contacto en relación con una población de células control, en el que una diferencia en la fluorescencia de dicha población de células puesta en contacto en comparación con dicha población de células control indica la actividad de una toxina clostridial que engloba la unión y la absorción celular de la toxina, la translocación en el citosol celular y la actividad proteasa.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha muestra es una toxina clostridial purificada, una toxina clostridial parcialmente purificada, una toxina clostridial sin purificar, una cadena ligera de toxina clostridial purificada, una cadena ligera de toxina clostridial parcialmente purificada, una cadena ligera de toxina clostridial sin purificar, una toxina clostridial en bruto, una toxina clostridial formulada, una formulación cosmética de toxina clostridial, una formulación clínica de toxina clostridial, una toxina clostridial recombinante, una cadena ligera de toxina clostridial recombinante, un alimento crudo, un alimento cocinado, un alimento parcialmente cocinado, un alimento procesado, un tejido, saliva de un mamífero, una excreción de un mamífero o una hez de un mamífero.

15. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que determinar la fluorescencia de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control comprende detectar un aumento de la fluorescencia del sustrato citoplasmático de la célula puesta en contacto como indicio de la actividad de una toxina clostridial; detectar una disminución de la fluorescencia del sustrato localizado en la membrana de la célula puesta en contacto como indicio de la actividad de una toxina clostridial; detectar un cambio en la intensidad de la fluorescencia del sustrato localizado en la membrana con respecto al sustrato citoplasmático de dicha célula puesta en contacto como indicio de la actividad de una toxina clostridial; o detectar un cambio en la intensidad de la fluorescencia del sustrato localizado en la membrana con respecto al sustrato citoplasmático de dicha célula puesta en contacto como indicio de la actividad de una toxina clostridial.