POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS BASB201 DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE NO TIPIFICABLE Y USOS DE LOS MISMOS.

Polipéptidos y polinucleótidos BASB201 de Haemophilus influenzae no tipificable y usos de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere a polinucleótidos (denominados en el presente documento "polinucleótido(s) BASB201"), a polipéptidos codificados por ellos (denominados en el presente documento "BASB201" o "polipéptido(s) BASB201"), a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la presente invención se refiere procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar infección por ciertos patógenos. Antecedentes de la invención Haemophilus influenzae es una bacteria gramnegativa no móvil. El hombre es su único huésped natural. Normalmente, los aislados de H. influenzae se clasifican según su cápsula polisacárida. Se han identificado seis tipos capsulares diferentes designados de la a a la f. Los aislados que no consiguen aglutinarse con antisuero cultivado contra uno de estos seis serotipos se clasifican como no tipificables y no expresan una cápsula. El H. influenzae tipo b es claramente diferente de los otros tipos, ya que es la causa principal de la meningitis bacteriana y de enfermedades sistémicas. Los H. influenzae no tipificables (NTHi) sólo se aíslan ocasionalmente de la sangre de pacientes con una enfermedad sistémica. Los NTHi constituyen una causa habitual de neumonía, exacerbación de bronquitis crónica, sinusitis y otitis media. La otitis media es una enfermedad infantil importante tanto por el número de casos como por sus potenciales secuelas. Cada año se registran en Estados Unidos más de 3,5 millones de casos y se estima que el 80% de los niños ha experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de tres años (1). Si se deja sin tratar, o si se vuelve crónica, esta enfermedad puede dar lugar a pérdida de audición, que puede ser temporal (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanente (si el nervio auditivo está dañado). En lactantes, esas pérdidas de audición pueden ser responsables del retraso en el aprendizaje del habla. Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae; NTHi y M. catarrhalis. Éstas están presentes en un 60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes demuestra que S. pneumoniae y NTHi representan cada una de ellos un 30% aproximadamente y M. catarrhalis un 15% aproximadamente de los casos de otitis media (2). Se pueden aislar otras bacterias del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes,...) pero a una frecuencia mucho menor (2 % de los casos o inferior). Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; no obstante, también son necesarios otros factores para dar lugar a la enfermedad (3-9). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguida de la iniciación de un proceso inflamatorio. Hasta la fecha, estos otros factores se desconocen. Se ha propuesto que, por ejemplo, una anomalía transitoria del sistema inmunitario después de una infección vírica podría provocar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (5). Una explicación alternativa es que la exposición a factores medioambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que, posteriormente, se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia constante de patógenos en el oído medio (2). Se puede acceder a H. influenzae Rd sección 75 de 163, 9 de agosto de1995 (1995-08-09) en la base de datos de EMBL [online] EBI con número de registro U32760. La proteína hipotética H10756 de H. influenzae se puede recuperar en la base de datos SWISSPROT [online] con número de registro P44864, Se ha demostrado que diversas proteínas de H. influenzae están involucradas en la patogenia o se ha demostrado que confieren protección después de la vacunación en modelos animales. Se ha informado de la adherencia del NTHi a células epiteliales de la nasofaringe humana (10). Además de las fimbrias y las pilosidades (11-15), se han identificado muchas adhesinas en NTHi. Entre ellas, dos proteínas de alto peso molecular expuestas en la superficie denominadas HMW1 y HMW2 han demostrado mediar en la adhesión de NTHi a células epiteliales (16). Otra familia de proteínas de alto peso molecular ha sido identificada en cepas de NTHi que carecen de proteínas pertenecientes a la familia HMW1/HMW2. La proteína Hia de 115 kDa de NTHi (17) es muy similar a la adhesina Hsf expresada por cepas de H. influenzae de tipo b (18). Otra proteína, la proteína Hap muestra similitudes con las serínproteasas IgA1 y se ha demostrado que está involucrada tanto en la adhesión como en la entrada a la célula (19). Se han identificado y se han numerado cinco proteínas mayoritarias de la membrana exterior (OMP). 2   En los estudios originales usando cepas de H. influenzae de tipo b demostraron que los anticuerpos específicos para P1 y P2 protegían a ratas no adultas frente a exposiciones posteriores (20-21). Se ha encontrado que la P2 es capaz de inducir anticuerpos bacterianos y opsónicos, que están dirigidos contra las regiones variables presentes en las estructuras en bucle expuestas sobre la superficie de esta OMP integral (22-23). La lipoproteína P4 también podía inducir anticuerpos bactericidas (24). P6 es una lipoproteína asociada con péptidoglicano conservada que constituye hasta el 1-5% de la membrana externa (25). Posteriormente se identificó una lipoproteína de aproximadamente el mismo peso molecular, denominada PCP (proteína de reacción cruzada con P6) (26). Una mezcla de las lipoproteínas conservadas P4, P6 y PCP no reveló ninguna protección tal y como se mide en un modelo de otitis media en chinchilla (27). La P6 sola parece inducir protección en el modelo de chinchilla (28). La P5 tiene una homología de secuencia con la OmpA integral de Escherichia coli (29-30). La P5 parece experimentar una deriva antigénica durante infecciones persistentes con NTHi (31). No obstante, regiones conservadas de esta proteína indujeron protección en el modelo de chinchilla de otitis media. En línea con las observaciones realizadas con gonococos y meningococos, el NTHi expresa un receptor doble de transferrina humana compuesto por TbpA y TbpB cuando se cultivan con limitación de hierro. Los anti-TbpB protegían a ratas lactantes. (32). También se han descrito para NTHi receptores de hemoglobina/haptoglobina (33). También se ha identificado un receptor para Haem:Hemopexina (34). En el NTHi también hay un receptor de lactoferrina, pero aún no se ha caracterizado (35). Una OMP de 80 kDa, el antígeno de superficie D15, proporciona protección frente a NTHi en un modelo de exposición en ratón. (36). Una lipoproteína de la membrana exterior de 42 kDa, la LPD, está conservada entre los Haemophilus influenzae e induce anticuerpos bactericidas (37). Se ha encontrado que una OMP minoritaria de 98 kDa (38) es un antígeno protector, esta OMP puede ser perfectamente una de las OMP inducibles por la limitación de Fe o de las adhesinas de alto peso molecular que se han caracterizado. H. influenzae produce actividad de proteasa IgA1 (39). Las proteasas IgA1 de NTHi presentan un alto grado de variabilidad antigénica (40). Se ha demostrado que otra OMP de NTHi, la OMP26, una proteína de 26 kDa, aumenta el aclaramiento pulmonar en un modelo de rata (41). También se ha demostrado que la proteína HtrA de NTHi es un antígeno protector. De hecho, esta proteína ha protegido a la chinchilla frente a otitis media y ha protegido a ratas lactantes frente a la bacteriemia producida por H. influenzae de tipo b (42). Referencias de los antecedentes 1. Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823 2. Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267 3. Dickinson, DP y col., (1988) J. Infect. Dis. 158:205 4. Faden, HL y col., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612 5. Faden, HL y col., (1994) J. Infect. Dis. 169:1312 6. Leach, AJ y col., (1994) Pediatr. Infect. Dis. J. 13:983 7. Prellner, KP y col., (1984) Acta Otolaryngol. 98:343 8. Stenfors, L-E y Raisanen, S. (1992) J. Infect. Dis. 165:1148 9. Stenfors, L-E y Raisanen, S. (1994) Acta Otolaryngol. 113:191 10. Read, RC. y col., (1991) J. Infect. Dis. 163:549 11. Brinton, CC. y col., (1989) Pediatr. Infect. Dis. J. 8:S54 12. Kar, S. y col., (1990) Infect. Immun. 58:903 13. Gildorf, JR. y col., (1992) Infect. Immun. 60:374 14. St. Geme, JW y col., (1991) Infect. Immun. 59:3366 15. St. Geme, JW y col., (1993) Infect. Immun. 61: 2233 16. St. Geme,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 2 o 6 sobre la longitud completa de dicha secuencia; o b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 97% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 4 u 8 sobre la longitud completa de dicha secuencia. 2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 4 u 8 sobre la longitud completa de dicha secuencia. 3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 2, 4, 6 ó 8. 4. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 2, 4, 6 ó 8. 5. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionado de: a) una secuencia de polipéptidos que tiene una identidad de al menos 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 2 o 6 sobre la longitud completa de dicha secuencia; o b) un polipéptido que tiene una identidad de al menos 97% con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 4 u 8 sobre la longitud completa de dicha secuencia; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado. 7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de: a) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 99% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionado de las SEC ID Nº 2, 4 o 6 sobre toda la región codificadora, o b) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 97% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº 8 sobre la totalidad de la región codificadora; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado. 8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de: a) una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos 99% con una secuencia de ADN seleccionada de las SEC ID Nº 1, 3 o 5 sobre la longitud completa de dicha secuencia; o b) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 97 % con una secuencia de ADN seleccionada de la SEC ID Nº 7 sobre la longitud completa de dicha secuencia; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado. 9. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la identidad es al menos del 99 % con una secuencia de ADN de la SEC ID Nº 7. 10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionado de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8. 11. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido seleccionado de las SEC ID Nº 1, 3, 5 ó 7. 12. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11. 13. El vector de expresión de la reivindicación 12, en el que el polinucleótido aislado es recombinante. 14. El vector de expresión de la reivindicación 12, que comprende una región en el lado 5 modificada de dicho polinucleótido, región en el lado 5 modificada que contiene un elemento regulador heterólogo fuerte de dicho polinucleótido. 15. Un microorganismo vivo recombinante que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. 16. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a   14 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 17. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 16 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo. 18. Un procedimiento para producir una vacuna que comprende las etapas de la reivindicación 17 y, además, que comprende la etapa de formular dicho polipéptido recombinante con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 19. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos. 20. Una vesícula de membrana externa bacteriana que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión que comprende dicho polipéptido, vesícula de membrana externa bacteriana que se puede obtener de una célula hospedadora de la reivindicación 16 en la que la célula hospedadora comprende el vector de expresión de la reivindicación 14. 21. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de: (i) un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o (ii) un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 ó 8; O (iii) una proteína de fusión que comprende el polipéptido de (i) o el fragmento inmunogénico de (ii); o (iv) la vesicula de membrana externa bacteriana de la reivindicación 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 22. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de: (i) un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11; o (ii) un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 23. La composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de H. influenzae no tipificable. 24. Un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 25. Un procedimiento de diagnóstico de una infección por H. influenzae no tipificable que comprende identificar un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo de la reivindicación 24, presente en una muestra biológica de un animal que se sospecha que sufre dicha infección. 26. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de: (i) un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o (ii) un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 ó 8; o (iii) una proteína de fusión que comprende el polipéptido de (i) o fragmento inmunogénico de (ii); o (iv) la vesicula de membrana externa bacteriana de la reivindicación 20 en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal. 27. Uso de una composición que comprende una cantidad eficaz de: (i) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11; o (ii) un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 36   en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal. 28. Una composición terapéutica para usar en el tratamiento de seres humanos con enfermedad por H. influenzae no tipificable, que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24 y un vehículo farmacéutico adecuado. 29. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de: (i) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o (ii) un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 ó 8; O (iii) una proteína de fusión que comprende el polipéptido de (i) o fragmento inmunogénico de (ii); o (iv) la vesicular de membrana externa bacteriana de la reivindicación 20 para usar en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal. 30. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de: (i) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11; o (ii) un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 y que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las mismas y siendo capaz dicho fragmento, si es necesario cuando está acoplado con un transportador, de producir una respuesta inmunitaria que reconoce un polipéptido de las SEC ID Nº 2, 4, 6 u 8 para usar en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal. 31. Una composición de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 para usar en el tratamiento o la prevención de la infección por H. influenzae no tipificable. 37   Figura 1: Alineación de las secuencias de polinucleótido BASB201. La identidad con la SEC ID Nº 1 se indica con un punto. El hueco se india con un guión. 38   39     41   Figura 2: Alineación de las secuencias de polipéptidos BASB201. La identidad con la SEC ID Nº 2 está indicada con un punto. El hueco se indica con un guión. 42   43   Figura 3: Predicción de la estructura bidimensional, epítopos de linfocitos B y epítopos de linfocitos T colaboradores de polipéptidos BASB201 44