Utilización de péptidos para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum.

La presente invención se encuadra dentro del sector del control de alimentos y en concreto, dentro del sector de los métodos de detección de microorganismos en alimentos basados en la utilización de ligandos específicos, concretamente se basa en el uso de péptidos que reconocen de forma específica los esporos de Clostridium tyrobutyricum presentes en una muestra. El uso de estos péptidos permite la detección y/o cuantificación rápida y específica de los citados esporos

Utilización de péptidos para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum.

La presente invención se encuadra dentro del sector del control de alimentos y en concreto, dentro del sector de los métodos de detección de microorganismos en alimentos basados en la utilización de ligandos específicos, concretamente se basa en el uso de péptidos que reconocen de forma específica los esporos de Clostridium tyrobutyricum presentes en una muestra. El uso de estos péptidos permite la detección y/o cuantificación rápida y específica de los citados esporos.

Estado de la técnica anterior

La fermentación butírica es un grave problema en la fabricación de quesos de pasta dura y semidura, que ocasiona pérdidas de millones de euros en el sector cada año. Dicho problema se manifiesta a lo largo de la maduración del queso y provoca un defecto conocido como la "hinchazón tardía". En España, una parte importante de la producción quesera se ve afectada potencialmente por este problema (Rilla et al., 2003. International Journal of Food Microbiology 85 (1): 23-33.; González et al., 2007. Food Control 18 (6): 716-722.; Anónimo (2007a). Resolución de 11 de Julio de 2007, del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Boletín Oficial de España 208: 36181-36182). El principal agente responsable de la fermentación butírica es Clostridium tyrobutyricum (Bergére y Sivelä, 1990. Bulletin of the International Dairy Federation 251: 15-23), una bacteria Gram positiva, formadora de esporos, anaerobia estricta y no patógena para humanos y animales (Wiedmann et al., 2000. Encyclopedia of Food Microbiology. Robinson RK, Batt CA y Patel PD (Editores), Academic Press, London, pp: 451-458), que procede fundamentalmente de los ensilados. Los esporos de Clostridium tyrobutyricum contaminan la leche y permanecen en ella hasta que se utiliza para la elaboración del queso, dado que el tratamiento térmico de pasteurización que recibe la leche, previamente, es insuficiente para inactivar los esporos (Franciosa et al., 1999. Journal of Food Protection. 62: 867-871).

A lo largo de la maduración del queso se produce la germinación de los esporos, seguida de una multiplicación de las formas vegetativas, que metabolizan el lactato y liberan como productos de la fermentación, gas (H₂ y CO₂) y ácido butírico (Rosen et al., 1989. Milchwissenschaft. 44 (6): 355-357; Herlin y Christiansson, 1993. Milchwissenschaft. 48 (12): 686-690). Como consecuencia, se pueden producir también defectos organolépticos en el queso como mal olor y sabor, debidos a la presencia de ácido butírico (Bergére y Favreau, 1987. Sciences des Aliments. 7 (nº hors-série VII): 89-98).

Los métodos actuales de análisis utilizados para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum son de tipo microbiológico y tardan 7 días en obtener un resultado, tiempo en el que la leche ha sido ya utilizada en la elaboración de queso. Actualmente, al no existir un método suficientemente rápido se añade a la leche destinada a la producción de quesos madurados, con carácter preventivo y de forma generalizada, la lisozima de huevo, que es un producto enzimático de elevado coste.

En el documento de patente US/2007/141628 se divulga un método para unir péptidos a superficies recubiertas con polietileno, comprendiendo dominios activos con un sitio de unión para agentes capaces de unirse en la superficie del polietileno. En este documento se menciona la secuencia SEQ ID NO: 1 pero no se menciona el uso reivindicado en la presente invención.

El documento de patente US/2007/065387 divulga el uso de agentes beneficiosos (acondicionadores y colorantes) y métodos para prolongar el tiempo de unión de estos agentes, revestidos con polímeros, a una superficie del cuerpo tal como pelo o piel, en presencia de una composición que abarca un péptido que tiene afinidad para el polímero. Se describen las secuencias de los péptidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 de la presente invención pero, al igual que en el documento anterior, no se menciona el uso reivindicado.

Los péptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 han sido citados en diversos documentos pero en ninguno de los casos se cita su uso para la detección de esporas de Clostridium tyrobutyricum.

Por otro lado, en un informe de la Doctoranda María Lavilla Martín sobre el proyecto de su Tesis doctoral: "Desarrollo de un método inmunoquímico para la detección y cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum en leche" se hace referencia a la descripción de los objetivos y metodología a desarrollar para detectar y cuantificar esporos de Clostridium tyrobutyricum pero en ningún caso se incluyen las secuencias peptídicas de la presente invención.

La utilización de estos péptidos expresados en fagos, en métodos de detección y cuantificación de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, supone una gran ventaja con respecto al método habitual de cuantificación de este microorganismo (método del número más probable) ya que se necesita 1 día frente a las incubaciones de hasta 7 días del método convencional.

Explicación de la invención

La presente invención se basa en el uso de péptidos que permiten la detección rápida y específica de los esporos de Clostridium tyrobutyricum presentes en una muestra. La detección de los esporos de este microorganismo se realiza en 1 día frente a los 7 días que se necesitan al emplear el método convencional (método del número más probable). El método convencional es poco específico, ya que no permite la diferenciación entre diferentes especies del género Clostridium. Además, los péptidos de la invención evitan de forma ventajosa la reactividad serológica no específica con otros microorganismos que se puede dar con la detección mediante métodos inmunoquímicos utilizando anticuerpos policlonales. Asimismo, se evita la laboriosidad de la obtención de anticuerpos monoclonales mediante creación de hibridomas y la falta de afinidad que estos anticuerpos suelen presentar. Otra ventaja de los péptidos con respecto a la utilización de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, es la posibilidad de la síntesis química de los mismos, que evita la necesidad de trabajar con animales de experimentación.

El término esporos hace referencia a las formas de resistencia que adoptan las bacterias, en el caso de esta invención, de la especie Clostridium tyrobutyricum ante condiciones ambientales desfavorables. Este término se utiliza como sinónimo de esporas.

Los péptidos son aislados mediante un procedimiento de selección por afinidad, a partir de una biblioteca de péptidos aleatorios expresados en la superficie de un bacteriófago (en adelante fago) (Phage display). Las secuencias de DNA de dichos péptidos se incluyen en el fago M13KE. De esta forma, el "Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit" contiene una librería de péptidos fusionados con una proteína de superficie del bacteriófago M13. De esta manera pueden seleccionarse aquellos péptidos que se unen de forma específica a los esporos de Clostridium tyrobutyricum, puede conocerse su secuencia nucleotídica y determinarse la secuencia aminoacídica resultante de las diferentes amplificaciones obtenidas.

En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un péptido seleccionado de la lista que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o cualquiera de sus combinaciones.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum. El péptido es seleccionado; de la lista anterior, de la lista que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, ó cualquier combinación de los péptidos de las dos listas anteriores.

El término esencialmente, en la presente invención, se refiere a las secuencias descritas anteriormente y a las siguientes secuencias derivadas de las mismas en el sentido que se describe a continuación:

- Secuencias resultantes de la eliminación de aminoácidos de las regiones N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:... [Seguir leyendo]

1. Péptido seleccionado de la lista que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o cualquiera de sus combinaciones.

2. Uso de un péptido seleccionado de entre