Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5.

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APOA5 mediante la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando el conjunto de cebadores reivindicado, y la detección mediante fluorescencia usando el conjunto de sondas reivindicado. Las principales ventajas de la presente invención son: gran rapidez que permite el genotipado a gran escala ya que la reacción de PCR y la detección de la señal fluorescente son simultáneas, asignación de genotipos automatizada y obtenible de forma inmediata al finalizar la reacción, gran sensibilidad que permite genotipar muestras empleando concentraciones muy bajas de ADN, y menor riesgo de contaminación al tratarse de un ensayo homogéneo

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5.

Estado de la técnica

Los polimorfismos genéticos de un solo nucleótido (en inglés "single nucleotide polimorphisms" o "SNPs") son la forma más frecuente de variación que se puede encontrar en el genoma humano. El estudio de la variabilidad genética tiene repercusión biosanitaria puesto que el papel que se atribuye a los SNPs es, junto con distintos factores ambientales, de moduladores de la susceptibilidad individual a padecer la mayoría de las enfermedades comunes (hipertensión, diabetes, obesidad, arteriosclerosis...). De este modo, el desarrollo de las técnicas de genotipado es un tema en auge actualmente y es el campo en el que se encuadra la invención.

La apolipoproteína A5 es uno de los componentes proteicos de los quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de alta densidad (HDL). Diferentes estudios (Pennachio LA and Rubin EM, 2003. Aterioscler Thromb Vasc Biol :23) han demostrado que, tanto en animales como en humanos, es un potente modulador de los niveles plasmáticos de triglicéridos, considerados un factor independiente de riesgo vascular. Desde el descubrimiento del gen en el año 2000 se han descrito (Talmud PJ, 2007. Atherosclerosis: 194), numerosas mutaciones y polimorfismos, algunos de ellos asociados a dislipemia y también a mayor riesgo de sufrir enfermedades vasculares. Este es el caso del polimorfismo S19W también denominado c.56C>G, uno de los cinco polimorfismos que identifican al haplotipo 3 (en relación al gen APO A5). El polimorfismo se encuentra en el tercer exón del gen y provoca el cambio del aminoácido 19 de la apolipoproteína A5 de serina a triptófano. Aparece en población europea con una frecuencia alrededor del 6% y diferentes estudios (Hubacek JA, 2005. Clin Chem Lab Med: 43) muestran su asociación con cambios en los niveles de TG, incluso con valores extremos (HTG grave).

El método descrito inicialmente (Talmud PJ, Hawe E, Martin S, Olivier M, Miller GJ, Rubin EM, Pennacchio LA, Humphries SE, 2002. Human Molecular Genetics: 11) para el genotipado de este polimorfismo, S19W, está basado en el sistema de PCR-RFLP, o genotipado por PCR y restricción, que es el que se utiliza de forma más común para el análisis individual de la mayoría de los SNPs conocidos. En este sistema se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa los fragmentos polimórficos del gen o genes en estudio, el fragmento amplificado se digiere, con un enzima de restricción concreto pues el polimorfismo suele causar la aparición o eliminación de un sitio de restricción y el perfil de bandas específico de cada genotipo se visualiza empleando geles de agarosa o acrilamida.

Las principales ventajas de la presente invención en relación al método convencional (PCR-RFLP) son: a. una mayor rapidez que permite el genotipado a mayor escala (mayor número de muestras) ya que la reacción de PCR y la detección de la señal fluorescente son simultáneas, la asignación de genotipos está automatizada y se obtiene inmediatamente al finalizar la reacción, b. mayor sensibilidad, debido al empleo de una señal fluorescente, por lo que se pueden genotipar muestras empleando concentraciones muy bajas de ADN genómico, c. menor riesgo de contaminación, al tratarse de un ensayo homogéneo, es decir el procedimiento se realiza en una sola etapa.

Otro método descrito en la literatura para el genotipado del polimorfismo que se incluye en la invención es el empleo del sistema denominado "ABI Prism SNaPshot multiplex system" (Corella D, Lai CQ, Demissie S, Cupples LA, Manning AK, Tucker KL, Ordovas JM, 2007. J Mol Med: 85), desarrollado por la empresa Applied Biosystems. Las secuencias de cebadores y sondas que se emplean en este sistema difieren completamente de las comprendidas en la presente invención, cuya principal ventaja en relación a este método es que el kit propuesto puede emplearse en cualquier máquina de PCR en tiempo real que detecte al menos dos colores (longitudes de onda) de fluorescencia, mientras que el sistema antes descrito y que forma parte del estado de la técnica depende del uso de los kits y aparatos de la empresa que ha desarrollado el método.

También es posible genotipar los polimorfismos de interés mediante secuenciación directa, sin embargo este sistema no se utiliza rutinariamente para el genotipado de un gran número de muestras sino para la detección de nuevos polimorfismos en los genes de interés.

El solicitante de la presente patente no tiene conocimiento de ninguna publicación que haga referencia a soluciones alternativas comparables a las que proporciona la invención para este polimorfismo.

Descripción detallada de la invención

Polimorfismo S19W: A lo largo de la descripción este término hace referencia a la variante nucleotídica del gen APO A5 definida por la aparición de un cambio C por G en la posición 56 de la región codificante (exón 3).

Ensayo: a lo largo de la descripción este término hace referencia al conjunto de procedimientos que permiten llevar a cabo el genotipado del polimorfismo.

Sondas lineales fluorogénicas: A lo largo de la descripción este término hace referencia a las secuencias nucleotídicas, complementarias de la región polimórfica de la variante, que llevan acoplado un fluorocromo en el extremo 5' y una molécula extintora en el extremo 3' de dicha secuencia.

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5.

El procedimiento, representado esquemáticamente en la Figura 1, consiste en una única reacción de PCR en la que se aprovecha la actividad 5' exonucleasa del enzima Taq polimerasa. En la reacción de PCR están presentes cuatro oligonucleótidos: dos cebadores específicos que flaquean el polimorfismo de interés y dos sondas lineales fluorogénicas, específicas de cada alelo. Estas sondas están marcadas en el extremo 5' con un fluorocromo de referencia, distinto para cada sonda, y una molécula extintora en el 3'. Cuando las sondas están intactas, la señal emitida por la excitación del fluorocromo de referencia es captada por la molécula extintora, debido a la proximidad física entre ambas, y por tanto no se detecta (figura 1a). La señal fluorescente, diferente para cada alelo, sí se detecta cuando la sonda híbrida con el alelo totalmente complementario y se libera el fluorocromo de referencia, por la actividad 5'rightarrow3' exonucleasa de la polimerasa, durante los ciclos de la reacción de PCR (figura 1b y 1c).

De este modo, constituye un primer objeto de la presente invención un conjunto de cebadores para el genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5, en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO1 y SED ID NO 2. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.

Constituye un segundo objeto de la presente invención un conjunto de sondas para el genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5, en el cual al menos dos de las sondas de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4. Preferentemente, dicho conjunto está formado por una primera sonda, específica del alelo más frecuente (19S), cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, y por una segunda sonda, específica...

1. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 caracterizado porque al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO1 y SED ID NO 2.

2. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2.

3. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.

4. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 caracterizado porque al menos dos de las sondas de dicho conjunto, una de ellas específica del alelo más frecuente (19S) y la otra específica del alelo menos frecuente (19W), presentan, respectivamente, secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4.

5. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto está formado por una primera sonda, específica del alelo más frecuente, cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, y por una segunda sonda, específica del alelo menos frecuente, hbox{cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 4.}

6. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de la primera sonda es idéntica a la SEQ ID NO 3, y la secuencia de nucleótidos de la segunda sonda es idéntica a la SEQ ID NO 4.

7. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque tanto la sonda específica del alelo más frecuente como la sonda específica del alelo menos frecuente están marcadas por fluorocromos de referencia distintos en el extremo 5' y en el extremo 3' con una molécula extintora.

8. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque la sonda específica del alelo más frecuente está marcada por fluorescencia en el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (Fam) y en el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra); y la sonda específica para el alelo menos frecuente está marcada por fluorescencia en el extremo 5' con hexaclorofluoresceína (Hex) y en el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra).

9. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 caracterizado porque comprende:

10. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 caracterizado porque comprende:

11. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque la detección mediante fluorescencia y genotipado se realiza usando las sondas descritas según la reivindicación 8 de forma que, en la mezcla de reacción, la sonda específica del alelo más frecuente se encuentra a una concentración de 100 nM, y la sonda específica del alelo menos frecuente se encuentra a una concentración en el rango de 100 a 300 nM.

12. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque, en la mezcla de reacción, la sonda específica del alelo menos frecuente se encuentra a una concentración de 200 nM.

13. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 caracterizado porque la amplificación mediante PCR comprende un paso inicial de desnaturalización del ADN y activación de la polimerasa de 5 minutos a 95ºC, y 40 ciclos con dos pasos: uno de desnaturalización de 30 segundos a 95ºC, y otro de hibridación y extensión.

14. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza 45 segundos a una temperatura comprendida en el rango de 60 - 68ºC.

15. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza a una temperatura de 64ºC.

16. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación 14 caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza separadamente: hibridación 30 segundos a una temperatura comprendida en el rango de 60 - 68ºC, y extensión 30 segundos a 72ºC.

17. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 según la reivindicación anterior caracterizado porque la hibridación se realiza a una temperatura de 64ºC.

18. Kit para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 que comprende al menos un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de sondas descrito según la reivindicación 7.

19. Kit para el genotipado del polimorfismo genético S19W del gen APO A5 que comprende al menos un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de sondas descrito según la reivindicación 8.