METODO PARA LA IDENTIFICACION DE VARIEDADES DE PIMIENTO.

El método comprende extraer el ADN de una muestra de pimentón,

amplificar enzimáticamente regiones de ADN específicas de variedades de pimiento, separar los productos de amplificación obtenidos en cada reacción de amplificación, e identificar la variedad de pimiento comparando los tamaños de los productos de amplificación obtenidos con patrones de variedades de pimiento. El procedimiento permite identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, distinguir las diferentes variedades de pimiento eventualmente presentes en una muestra de pimentón y detectar las posibles adulteraciones de dicho pimentón con una variedad de pimiento distinta de la que caracteriza a la denominación origen

Método para la identificación de variedades de pimiento.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con patrones de amplificación específicos de variedades de pimiento y su empleo en un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la fabricación de pimentón así como en la identificación de la variedad de pimentón empleada en la elaboración de productos alimentarios.

Antecedentes de la invención

Muchos derivados de productos agrícolas empleados en la industria alimentaria tienen un valor comercial reconocido basado en la especie vegetal de la que se obtiene, de forma que tal especie suele figurar en la etiqueta y estar explícitamente reconocida en las transacciones comerciales. Frecuentemente, de forma fraudulenta, productos genuinos se sustituyen total o parcialmente con otros procedentes de especies diferentes de plantas con menor coste y calidad.

El pimentón es el polvo del pimiento rojo una vez que éste se ha desecado y molido. En España, las zonas pimentoneras más importantes son Murcia y la comarca de la Vera (Cáceres), donde se produce un pimentón cuyas señas de identidad son la utilización de variedades autóctonas, cultivo artesanal y deshidratación lenta en secaderos alimentados con leña de encina. Sin embargo, la venta de mezclas de pimentón procedente del extranjero con diversas proporciones de pimentón procedente de la comarca de la Vera, sigue proporcionado elevadísimos márgenes de rentabilidad a aquellos industriales que basan su producción en la mezcla de estos, lo que evidentemente constituye un fraude al consumidor.

Los marcadores moleculares (fragmentos de ADN) presentan un gran potencial para la identificación intraespecífica. La técnica AFLP (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos Amplificados) ha proporcionado una nueva clase de marcadores altamente polimórficos. Su ventaja sobre otros marcadores es su alta reproducibilidad lo que unido a su carácter polimórfico les confiere una enorme capacidad para discernir entre especies e incluso entre variedades. Mediante la comparación de secuencias génicas específicas entre distintas variedades de una especie se pueden detectar un gran número de diferencias en la secuencia nucleotídica que permiten identificar y distinguir unas variedades de otras. Estas diferencias pueden ser de tipo SNP (Single Nucleotide Sequence) que pueden utilizarse como marcadores moleculares de la misma forma que los microsatélites o "short-sequence repeat tandem" (SSRT).

La identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración del pimentón es muy importante para poder garantizar el auténtico origen ("denominación de origen") de dicho pimentón y descartar aquellos pimentones que hayan sido adulterados utilizando variedades de pimiento no pertenecientes a la variedad de pimiento usada en la denominación de origen en cuestión. Actualmente, no se realiza ningún tipo de procedimiento analítico para detectar mezclas, debido a que no se han identificado metabolitos característicos de especies. Tan solo se conoce que la variedad de pimiento Papriqueen tiene niveles de azúcares reductores más elevados que las demás variedades, pero esto no es suficiente para diferenciarla. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un procedimiento que permita distinguir entre las diferentes variedades de pimiento eventualmente presentes en una muestra de pimentón con el fin de detectar las posibles adulteraciones de dicho pimentón con una variedad de pimiento distinta de la que caracteriza a la denominación origen.

Compendio de la invención

Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que mediante el empleo de unos oligonucleótidos iniciadores que amplifican unas regiones específicas del genoma de una variedad de pimiento dado, se puede elaborar un patrón de amplificación específico de dicha variedad de pimiento, que permite su identificación entre otras variedades de pimiento presentes en una muestra de pimentón.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento. Los patrones de amplificación específicos de dichas variedades de pimiento obtenibles mediante la puesta en práctica de dicho método constituyen un aspecto adicional de la presente invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o de un producto alimentario.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para cuantificar la cantidad de pimentón procedente de una determinada variedad de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende, al menos, dos parejas de cebadores específicos proporcionados por esta invención. El uso de dicho kit en la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, o en la identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o un producto alimentario, o en la cuantificación de la cantidad de pimentón procedente de una variedad de pimiento determinada en una muestra de pimentón o de un producto alimentario, constituyen aspectos adicionales de esta invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades Jaranda o Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Paprequeen, Papriking y Cayena con la pareja de cebadores PNBT1 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). Las flechas muestras los picos diagnóstico.

La Figura 2 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades Jaranda o Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Sonora, Paprequeen, Papriking y Cayena con la pareja de cebadores PNBT2 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4). Las flechas muestran los picos diagnóstico.

La Figura 3 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades nacionales Jaranda o Autóctono y las variedades extranjeras Bola, Papriace, Sonora, Papriqueen y Papriking, con la pareja de cebadores PNBT3 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6). Las flechas muestran los picos diagnóstico.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, de aquí en adelante, método de obtención de patrones de la invención, que comprende:

        a)        extraer el ADN de una muestra de dicha variedad de pimiento,

        b)        someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento, y

        c)         separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación y elaborar el "patrón" específico de dicha variedad de pimiento, relacionando el producto amplificado con la pareja de cebadores utilizada.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "variedad" se refiere a un conjunto de plantas dentro de un taxón botánico único del rango más bajo conocido, que pueden ser (a) definidas por la expresión de las características que resultan de un genotipo dado o combinación de genotipo, (b) distinguidas de cualquier otro grupo de plantas por expresión de, al menos, una de dichas características, y (c) consideradas como una unidad con respecto a su disponibilidad para ser propagadas de forma inalterada. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de variedades de pimientos incluyen la variedad Jaranda y Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena, Dulce/Bola (variedades extranjeras) etc.

El término "patrón de amplificación", tal como aquí se utiliza, se refiere a un conjunto de bandas o picos obtenidos tras separar mediante electroforesis los productos de una reacción de amplificación utilizando unos cebadores determinados. En la presente invención, puesto que la reacción/es de amplificación se lleva/n...

1. Un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento que comprende:

        a)        extraer el ADN de una muestra de dicha variedad de pimiento,

        b)        someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento, y

        c)        separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación y elaborar el "patrón" específico de dicha variedad de pimiento, relacionando el producto amplificado con la pareja de cebadores utilizada.

2. Método según la reivindicación 1, en la que la etapa b) comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes.

3. Método según la reivindicación 1, en la que la etapa b) comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las parejas de cebadores diferentes se seleccionan entre las siguientes parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha reacción de amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región de ADN específica de la variedad de pimiento contiene marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis seguido de un electroferograma.

8. Un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento obtenible mediante la puesta en práctica de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Papriking y comprende

        (i)        un pico de 269 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,

        (ii)        un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y

        (iii)        un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.

10. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Papriqueen y comprende

        (i)        un pico de 285 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,

        (ii)        un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y

        (iii)        un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.

11. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Cayena y comprende un pico de 280 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1.

12. Patrón de amplificación según la reivindicación 11, que comprende, además, dos picos de 144 y 148 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.

13. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad de pimiento Sonora o Papriace y comprende una banda de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.

14. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad Bola y comprende un pico de 333 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.

15. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad Jaranda o Autóctono y comprende un pico de 151 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.

16. Un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o un producto alimentario, que comprende las etapas de

        a)        extraer el ADN de una muestra de dicho pimentón o dicho producto alimentario,

        b)        someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde cada pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de cada variedad de pimiento,

        c)        separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación, y

        d)        identificar la variedad de pimiento mediante la comparación de los tamaños de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación con un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.

17. Método según la reivindicación 16, en la que la etapa b) comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes.

18. Método según la reivindicación 16, en la que la etapa b) comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la parejas de cebadores diferentes se selecciona entre las siguientes parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la reacción de amplificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la región de ADN específica de la variedad de pimiento está caracterizada por contener marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que el patrón de amplificación específico de la variedad de pimiento es un patrón según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

24. Un método para cuantificar la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario que comprende:

        a)        identificar la presencia de dicha variedad "A" de pimiento mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23,

        b)        a partir de las cantidades relativas de los fragmentos separados, generar un electroferograma que contiene los picos representativos (marcas) de dicha variedad "A" de pimiento para una pareja de cebadores determinada,

        c)        calcular la razón existente entre (i) la altura de un pico representativo de dicha variedad "A" de pimiento y (ii) la altura de un pico representativo una variedad de pimiento de referencia recogidas en el electroferograma obtenido al amplificar dichas variedades de pimiento con la misma pareja de cebadores, y

        d)        extrapolar dicha razón a una recta de calibrado realizada con una mezcla de pimentón procedente de la variedad "A" de pimiento y la variedad de referencia en distintas cantidades.

25. Método según la reivindicación 24, en el que la variedad de pimiento "A" identificada es Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena o Bola.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, en el que la variedad nacional de referencia es Jaranda o Autóctono.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que la pareja de cebadores se selecciona entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

28. Un kit que comprende, al menos, dos parejas de cebadores seleccionadas entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

29. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.

30. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o un producto alimentario.

31. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la cuantificación de la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario.