METODO PARA AUMENTAR LA RECUPERACION IN VIVO DE POLIPEPTIDOS TERAPEUTICOS.

Uso de un polipéptido terapéutico, fusionado directamente o a través de un péptido engarzador con un polipéptido que intensifica la recuperación in vivo,

en comparación con la recuperación in vivo del correspondiente polipéptido terapéutico no fusionado, y en que el polipéptido que intensifica la recuperación es una albúmina, una variante polimórfica presente en la naturaleza o un fragmento de la misma, en que el fragmento tiene una longitud de por lo menos 20 aminoácidos, para aumentar la recuperación in vivo

Campo del invento:

El presente invento se refiere al campo de los polipéptidos terapéuticos modificados con una recuperación in vivo aumentada en comparación con su polipéptido progenitor no modificado. Es decir, el invento se refiere a unas fusiones de polipéptidos terapéuticos con unos polipéptidos que intensifican la recuperación, que están conectados directa u opcionalmente por un péptido engarzador.

La esencia del invento es demostrada en particular por unos polipéptidos dependientes de la vitamina K, tales como p.ej. el Factor VII humano, el Factor VIIa humano, el Factor IX humano y la proteína C humana como el polipéptido terapéutico, y por una albúmina como el polipéptido que intensifica la recuperación. Por lo tanto, en particular, el invento se refiere también a 20 unas secuencias de ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) que codifican cualquiera de los polipéptidos dependientes de la vitamina K y sus derivados, fusionados genéticamente con un ADNc que codifica una albúmina de suero humano, que se pueden engarzar por unos 25 oligonucleótidos que codifican unos engarzadores peptídicos intermedios, exhibiendo dichos derivados codificados una recuperación in vivo mejorada, a unos vectores de expresión recombinantes que contienen dichas secuencias de ADNc, a células anfitrionas transformadas con dichos vectores de expresión recombinantes, a polipéptidos recombinantes y sus derivados que tienen unas actividades biológicas comparables con las del polipéptido de tipo salvaje sin modificar, pero que tienen una mejorada recuperación in vivo, y a procedimientos para la producción de dichos polipéptidos recombinantes y de sus derivados. El invento cubre 5 también a un vector de transferencia destinado a usarse en la terapia génica humana, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas que son útiles para aumentar los niveles del producto in vivo.

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Antecedentes del invento:

Polipéptidos terapéuticos

Son polipéptidos terapéuticos en el sentido de este invento unas proteínas o unos polipéptidos que, después 15 de su aplicación a un ser humano o animal, pueden producir un efecto profiláctico o terapéutico. Estos polipéptidos terapéuticos son aplicados a un ser humano o a un animal por las vías oral, tópica, parenteral u otras. Unas clases específicas de polipéptidos 20 terapéuticos cubiertos, es decir por los ejemplos en este invento, son los polipéptidos dependientes de la vitamina K que en cierta extensión están disponibles comercialmente en su versión derivada de un plasma o recombinante. 25

Polipéptidos intensificadores de la recuperación

Son polipéptidos intensificadores de la recuperación en el sentido de este invento cualesquiera polipéptidos o proteínas que, después de su fusión con un polipéptido 30 terapéutico aumentan la recuperación in vivo de la fusión, en comparación con la del polipéptido terapéutico no modificado. Ejemplos específicos de dichos polipéptidos intensificadores de la recuperación son una albúmina, variantes o fragmentos de la misma, e inmunoglobulinas, variantes o fragmentos de las mismas.

Recuperación in vivo 5

La recuperación in vivo es definida como el porcentaje de un polipéptido terapéutico, que es detectable en la circulación después de un breve periodo de tiempo después de la aplicación (5-10 minutos) en relación con la cantidad total de polipéptido terapéutico 10 que se ha administrado. Como una base para el cálculo de la concentración esperada del polipéptido terapéutico en la circulación, se supone en general un volumen de plasma de 40 ml por kg.

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Proteínas de fusión o polipéptidos de fusión

Son proteínas de fusión o polipéptidos de fusión, en el sentido de este invento, unas proteínas que pueden ser expresadas a partir de construcciones artificiales genéticas, que comprenden un ácido nucleico que codifica 20 un polipéptido terapéutico o variantes del mismo y un ácido nucleico que codifica un polipéptido intensificador de la recuperación, en cuya construcción artificial ambos ácidos nucleicos están engarzados en cuadro de una manera tal que la expresión en una célula anfitriona en la que 25 se ha introducido dicha construcción artificial genética, genera una proteína en la que el polipéptido terapéutico está engarzado por un engarce peptídico con el polipéptido intensificador de la recuperación. Opcionalmente, el polipéptido terapéutico y el 30 polipéptido intensificador de la recuperación pueden estar también conectados por un corto engarzador peptídico.

Polipéptidos dependientes de la vitamina K

Los polipéptidos dependientes de la vitamina K que 5 son modificados después de la traducción mediante carboxilación en posición gamma y comprenden p.ej. los Factores de coagulación de la sangre II (protrombina), VII, IX y X, las proteínas anticoagulantes C y S, y la proteína Z que dirige hacia la trombina, la proteína ósea 10 osteocalcina, la proteína de matriz que inhibe la calcificación, la proteína del gen 6 específico para la detención del crecimiento (Gas6) que regula el crecimiento de las células, y las cuatro proteínas Gla transmembranales (TMGPs) cuya función es en el momento 15 actual desconocida. Entre estos polipéptidos, algunos se usan para tratar ciertos tipos de hemofilia y trastornos hemorrágicos. La hemofilia A es un trastorno hemorrágico heredado. Resulta de una deficiencia de Factor VIII de coagulación de la sangre que está vinculada con el 20 cromosoma X y la manifestación clínica es una tendencia aumentada a la hemorragia. La enfermedad es tratada por inyección de concentrados del FVIII procedentes de un plasma o de fuentes recombinantes. La hemofilia B es causada por el Factor IX no funcional o ausente, y es 25 tratada con concentrados del Factor IX procedentes de un plasma o con una forma recombinante del Factor IX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B, el problema médico más grave para tratar la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de 30 reemplazo. Hasta aproximadamente un 30 % de todos los pacientes de hemofilia A desarrolla anticuerpos para el Factor VIII. Los anticuerpos para el Factor IX son menos frecuentes.

El modelo actual de la coagulación señala que el desencadenamiento fisiológico de la coagulación es la formación de un complejo entre un Factor tisular (TF) y 5 el Factor VIIa (FVIIa) sobre la superficie de células que expresan el TF, que normalmente están situadas fuera de la vasculatura. Esto conduce a la activación del Factor IX y del Factor X, generando finalmente algo de trombina. En un bucle de retroalimentación positiva la trombina 10 activa - directa o indirectamente - al Factor VIII y al Factor IX, el denominado brazo “intrínseco” de la cascada de coagulación de la sangre, amplificando de esta manera la generación del Factor Xa, que es necesario para la generación del estallido completo de trombina con el fin 15 de conseguir una hemostasia. Se mostró que por administración de concentraciones suprafisiológicas del Factor VIIa se puede conseguir una hemostasia, evitando la necesidad del Factor VIIIa y del Factor IXa. La clonación del ADNc para el Factor VII (documento de 20 patente de los EE.UU. US 4.784.950) hace posible desarrollar el Factor VII activado como un producto farmacéutico. El Factor VIIa fue administrado satisfactoriamente por primera vez en 1988. Desde entonces, el número de indicaciones del Factor VIIa ha 25 crecido constantemente, mostrando un potencial de convertirse en un agente hemostático universal para detener una hemorragia (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, el corto período de tiempo de semivida del Factor VIIa, de aproximadamente 2 horas, y la reducida recuperación in 30 vivo están limitando su aplicación.

Factor VII y Factor VIIa

El FVII es una glicoproteína monocatenaria con un peso molecular de 50 kDa, que es segregada por células hepáticas dentro del torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene 10 residuos de 5 ácido γ-carboxi-glutámico localizados en el dominio Gla terminal de N del polipéptido. Los residuos de Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. En el extremo terminal de C con respecto del dominio Gla están localizados dos dominios de factores de crecimiento 10 epidérmico seguidos por un dominio de serina proteasa del tipo de tripsina. Unas modificaciones adicionales del FVII...

1. Uso de un polipéptido terapéutico, fusionado directamente o a través de un péptido engarzador con un polipéptido que intensifica la recuperación in vivo, en 5 comparación con la recuperación in vivo del correspondiente polipéptido terapéutico no fusionado, y en que el polipéptido que intensifica la recuperación es una albúmina, una variante polimórfica presente en la naturaleza o un fragmento de la misma, en que el 10 fragmento tiene una longitud de por lo menos 20 aminoácidos, para aumentar la recuperación in vivo.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido terapéutico comprende una proteína dependiente de la vitamina K. 15

3. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el polipéptido terapéutico comprende el Factor IX, el Factor VII o el Factor VIIa o un fragmento o una variante de los mismos.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en 20 el que el residuo de polipéptido terapéutico está fusionado con el extremo terminal de N del residuo de albúmina.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polipéptido terapéutico es el Factor VII o el 25 Factor VIIa.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque un engarzador peptídico separa al residuo del Factor VII o del Factor VIIa con respecto del residuo de albúmina. 30

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el engarzador peptídico es modificado por la inserción de sitios para modificaciones posteriores a la traducción.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la modificación posterior a la traducción comprende uno o más sitios de glicosilación en 5 N con la estructura Asn - X - Ser/Thr, en que X designa a cualquier aminoácido excepto prolina.

9. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 hasta 8, caracterizado porque el residuo del polipéptido Factor VII tiene una actividad procoagulante. 10

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polipéptido terapéutico es el Factor IX.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque un engarzador peptídico separa al residuo del Factor IX con respecto del residuo de 15 albúmina.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el engarzador peptídico es modificado por la introducción de sitios para modificaciones posteriores a la traducción. 20

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la modificación posterior a la traducción comprende uno o más sitios de glicosilación en N con la estructura Asn - X - Ser/Thr, en que X designa a cualquier aminoácido excepto prolina. 25

14. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 13, caracterizado porque el residuo del polipéptido Factor IX tiene una actividad procoagulante.