Compuesto que comprende una molécula de naturaleza lipídica y un grupo vinilsulfona que permite llevar a cabo la lipidación de biomoléculas de una forma altamente eficaz y sencilla.

La invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más concretamente se refiere al uso de estos compuestos en el desarrollo de dos nuevas aplicaciones de los ISCOMs basadas en la capacidad de nanoencapsulación y la incorporación de anticuerpos a la membrana de los mismos: a) Su empleo en inmunomarcaje fluorescente; b) Desarrollo de sistemas para el transporte dirigido de fármacos

Sistemas lipídicos funcionalizados con vinilsulfonas. Síntesis y usos.

La presente invención se refiere a un nuevo compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula de naturaleza lipídica y un grupo vinilsulfona que permite llevar a cabo la lipidación de biomoléculas de una forma altamente eficaz y sencilla. La presente invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente se refiere al uso de estos compuestos en el desarrollo de dos nuevas aplicaciones de los ISCOMs basadas en la capacidad de nanoencapsulación y la incorporación de anticuerpos a la membrana de los mismos: a) Su empleo en inmunomarcaje fluorescente; b) Desarrollo de sistemas para el transporte dirigido de fármacos.

Estado de la técnica anterior

Tras el gran desarrollo de la genómica y la proteómica, la lipidómica (Wenk, M. R. Nature Reviews Drug Discovery (2005), vol. 4 (7), pp 594-610.) ha surgido como un nuevo campo de investigación que avanza rápidamente y que tiene una gran importancia ya que, al igual que los genes y las proteínas, los lípidos también desempeñan funciones cruciales en las células. La lipidómica se dedica al estudio y caracterización del conjunto de las especies lipídicas celulares, las moléculas y macromoléculas con las que interactúan y sus funciones biológicas.

A diferencia de lo que ocurre con otro tipo de biomoléculas, los lípidos no se definen mediante una característica estructural común sino por un comportamiento físico-químico: su insolubilidad en agua. Clásicamente se ha considerado que los lípidos cumplen dos funciones generales, una estructural, en las biomembranas, y como reserva energética. Sin embargo, los avances tecnológicos han puesto de manifiesto la existencia de miles de especies lipídicas diferentes en el cuerpo humano sugiriendo la existencia de funciones aún no exploradas como son la señalización celular, el direccionamiento de proteínas hacia su destino celular, el anclaje de proteínas a membranas y la entrada de toxinas, virus y bacterias. Así por ejemplo, los lípidos de membrana, a través de sus interacciones con las proteínas integrales o asociadas a membrana modulan la función de éstas, su anclaje y tráfico. De hecho, existen enfermedades asociadas a un balance defectuoso de lípidos como la aterosclerosis, la obesidad, la diabetes y la enfermedad de Alzheimer.

Los principales objetivos de la lipidómica son:

- Nuevas aproximaciones analíticas para la caracterización del lipidoma.

- Aplicación de métodos biofísicos para el estudio de las interacciones lípido-proteína principalmente en los micro- y nanodominios de las membranas biológicas. Para este tipo de estudios es necesaria, entre otras cosas, la síntesis de lípidos específicos, análogos y sondas.

- Identificación de la red lipídica, incluyendo los mediadores lipídicos para la regulación metabólica y génica y su integración en sistemas de señalización no lipídicos.

La actividad de las proteínas no está únicamente controlada por la velocidad de síntesis y degradación sino también por procesos específicos y selectivos de modificación covalente o modificación post-transduccional que modulan interacciones moleculares, localización de proteínas y estabilidad. De las diferentes modificaciones post-transduccionales que pueden sufrir las proteínas una de ellas es la lipidación, siendo la más relevante la acilación con ácidos grasos. La acilación de proteínas con ácidos grasos implica principalmente a dos de ellos el palmítico y el mirístico. La unión a las proteínas puede darse a través de la formación de distintos tipos de enlaces:

- Formación de un enlace amida con un residuo de glicina N-teminal. o con el grupo varepsilon-amino de las lisinas.

- Formación de un enlace tioéster con un residuo de cisteína a través de una S-acilación.

- Formación de un enlace éster con residuos de serina o treonina.

La incorporación de ácidos grasos a la estructura de las proteínas facilita la interacción de éstas con las membranas así como su transporte a través de las mismas. Además, modula ciertas interacciones proteína-proteína y diversos procesos de señalización. Debido al gran número de mecanismos celulares en los que las proteínas modificadas con grupos de naturaleza lipídica se encuentran implicadas, tiene un gran interés el estudio físico-químico de este tipo de proteínas y de las interacciones en las que intervienen (proteína-proteína y proteína-membrana). La purificación de péptidos y proteínas modificadas con grupos lipídicos no es sencilla debido a su baja concentración celular y a la solubilidad de las mismas. Una posible alternativa consiste en la acilación química de proteínas para su posterior utilización en este tipo de estudios (Draper, J. M. et al. Journal of Lipid Research (2007), vol. 48 (8), pp 1873-1884).

Sin embargo, la acilación de proteínas presenta muchas otras aplicaciones. Así por ejemplo, se ha observado que aunque la modificación con ácidos grasos de péptidos antimicrobianos es bastante rara la obtención de conjugados sintéticos mejora esta actividad (Chu-Kung, A. F. et al. Bioconiugate Chemistry (2004), vol. 15 (3), pp 530-535). Los lipopéptidos pueden ser utilizados también en el etiquetado de receptores intracelulares (Thiam, K. et al. Journal of Medicinal Chemistry (1999), vol.42 (18), pp 3732-3736) y en el desarrollo de vacunas sintéticas (Deprez, B. et al. Vaccine 1996, vol. 14 (5), pp 375-382).

El empleo de proteínas o péptidos terapéuticos para el tratamiento de ciertas enfermedades presenta una enorme importancia en farmacología y biotecnología, además, tiene un gran potencial debido a su elevada especificidad. Sin embargo, su aplicación clínica está limitada, entre otros motivos, por su baja permeabilidad a través de membranas biológicas debido al carácter hidrofílico de estas proteínas. La modificación de péptidos y proteínas con grupos hidrofóbicos, como los ácidos grasos, constituye hoy día una de las posibilidades para aumentar su transporte a través de membranas biológicas (Kocevar, N. et al. Chemical Biology & Drug Design (2007), vol. 69 (2), pp 124-131). Mediante esta metodología no sólo se mejora la capacidad de las proteínas para interaccionar con las membranas sino que, además, se mantiene la actividad biológica de las mismas. De hecho, esta es una de las metodologías que se utiliza para el transporte de agentes terapéuticos hasta el sistema nervioso central a través de la barrera hematoencefálica (Kabanov, A. V. et al. Current Pharmaceutical Design (2004), vol. 10 (12), pp 1355-1363) para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Los sistemas proteína-lípido van más allá. La incorporación de proteínas a liposomas está adquiriendo día a día un mayor interés debido, fundamentalmente, a dos razones:

- Estudios de procesos en membranas. El estudio de interacciones proteína-liposoma puede contribuir a entender los procesos que tienen lugar en las membranas naturales.

- Dirección de fármacos. La unión de ciertas proteínas a liposomas puede ayudar a crear sistemas de dirección de fármacos.

La incorporación de péptidos y proteínas a liposomas se puede llevar a cabo mediante dos estrategias diferentes: a través de la inclusión de proteínas en el liposoma durante la formación del mismo o mediante la unión de la proteína a la bicapa lipídica del liposoma. En esta última opción es necesario que la proteína contenga una región hidrofóbica para que se establezca la asociación y para ello, en muchas ocasiones, se ha llevado a cabo la incorporación química de ácidos grasos mediante unión covalente sobre la estructura de la proteína.

En terapia génica, la incorporación in vivo de material genético en el interior de células somáticas constituye la metodología ideal. De hecho, la incorporación de material genético en cultivos de células eucariotas es una técnica estándar de gran importancia para el desarrollo de la Biología Molecular moderna. Los vectores víricos, como los retrovirus o los adenovirus, son muy efectivos pero llevan asociados problemas de toxicidad e inmunogenicidad. Una alternativa es el empleo de métodos no virales entre los cuales los liposomas catiónicos parecen muy prometedores, de hecho ya se... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula general (I):

donde:

Y es un grupo -CH₂-SO₂R¹- o -CH₂-;

R¹ es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C₁-C₁₀), un alquenilo (C₁-C₁₀), un alquinilo (C₁-C₁₀), un dialquilarilo (C₁-C₁₀)Ar(C₁-C₁₀) o un grupo (CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂;

n toma valores de 1 a 20;

X es un grupo -CO-NH-R²-Z-CH₂-, -Z-CH₂- o -CH₂-;

Z es S ó O;

R² es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C₁-C₁₀), un alquenilo (C₁-C₁₀), un alquinilo (C₁-C₁₀), un dialquilarilo (C₁-C₁₀)Ar(C₁-C₁₀) ó un grupo (CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂;

m toma valores de 1 a 20; y

representa un lípido.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde el lípido es un esterol.

3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el esterol se selecciona de la lista que comprende colesterol, epicolesterol, estigmasterol, lanosterol, ergosterol y coprostenol.

4. Compuesto según la reivindicación 3, donde el esterol es colesterol.

5. Compuesto según la reivindicación 1, donde el lípido es un hidrocarburo alifático (C₄-C₃₀) saturado.

6. Compuesto según la reivindicación 1, donde el lípido es hidrocarburo alifático (C₄-C₃₀) insaturado.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, donde el lípido es hidrocarburo alifático (C₁₀-C₂₀).

8. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 7, donde X es un grupo -CO-NH-R²-Z-CH₂- y Z se ha definido en la reivindicación 1.

9. Compuesto según la reivindicación 8 donde R² es un grupo alquilo (C₂-C₅).

10. Compuesto según la reivindicación 9 donde R² es un grupo etilo.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde X es el grupo -Z-CH₂- y Z se ha definido en la reivindicación 1.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde Z es O.

13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde Z es S.

14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde X es -CH₂-.

15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el grupo Y es -CH₂-.

16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde R¹ es un grupo (CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂ y n toma valores de entre 1 a 10.

17. Compuesto según la reivindicación 16, donde n toma valores de entre 2 a 5.

18. Compuesto según la reivindicación 17, donde n es 2.

19. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

20. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

21. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

22. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

23. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

24. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula:

25. Método de obtención de los compuestos de fórmula general (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:

a) reacción de una amina de fórmula general H₂N-R²-ZH con un cloruro de ácido de fórmula general (IV).

donde: 36, Z y R² se han definido en la reivindicación 1.

b) Reacción del compuesto obtenido en el paso (a) con una bis-vinilsulfona de fórmula general (VIII):

donde: Y se ha definido en la reivindicación 1.

26. Método de obtención de los compuestos de fórmula general (I), según la reivindicación 13, que comprende:

a) reacción de una diamina de fórmula general H₂N-R²-S-S-R²-NH₂ con un cloruro de ácido de fórmula general (IV):

Donde; 39 y R² se han definido en la reivindicación 1.

b) reducción del puente disulfuro del compuesto obtenido en el paso (a).

c) reacción del compuesto obtenido en el paso (b) con una bis-vinilsulfona de fórmula general (VIII) descrita en la reivindicación 25.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, donde R² es un grupo alquilo C₂-C₅.

28. Método según la reivindicación 27 donde R² es un grupo etilo.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, donde Y es el grupo -CH₂-SO₂-R¹- y R¹ está definido en la reivindicación 1.

30. Método de obtención de los compuestos de fórmula general (I) según la reivindicación 11, que comprende la reacción de un compuesto de fórmula general (IX) con una bis-vinilsulfona de fórmula (VIII), descrita en la reivindicación 25:

Donde; y Z se han definido en la reivindicación 1.

31. Método según la reivindicación 30 donde Y es el grupo -CH₂-SO₂-R¹- y R¹ está definido en la reivindicación 1.

32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 o 30, donde la bis-vinilsulfona de fórmula (VIII) es divinilsulfona.

33. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 como agente de lipidación.

34. Uso del compuesto según la reivindicación 33, para la lipidación de biomoléculas.

35. Uso del compuesto según la reivindicación 34 donde las biomoléculas son proteínas.

36. Uso del compuesto según la reivindicación 35 donde la proteína es la proteína A o la proteína G.

37. Bioconjugado covalente que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y una biomolécula.

38. Bioconjugado según la reivindicación 37, donde la biomolécula es una proteína.

39. Bioconjugado según la reivindicación anterior, donde la proteína es la proteína A o la proteína G.

40. Sistema que comprende el bioconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 incorporado en la membrana de una nanocaja.

41. Sistema según la reivindicación 40, donde la nanocaja es un ISCOM.

42. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 40 o 41, que además comprende un anticuerpo unido a la nanocaja a través de la biomolécula.

43. Complejo no covalente que comprende al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-24 incorporados a la estructura de una nanocaja.

44. Complejo según la reivindicación 43, donde la nanocaja es un ISCOM.

45. Uso de un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 43 o 44, para la unión de biomoléculas mediante los grupos vinilsulfona.

46. Uso del complejo según la reivindicación 45 donde las biomoléculas son proteínas.

47. Uso del complejo según la reivindicación 46 donde la proteína es proteína A o proteína G.

48. Sistema que comprende el complejo según cualquiera de las reivindicaciones 43 o 44, y una biomolécula unida covalentemente a través de los grupos vinilsulfona.

49. Sistema según la reivindicación 48 donde la biomolécula es una proteína.

50. Sistema según la reivindicación 49 donde la biomolécula es la proteína A o la proteína G.

51. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, que además comprende un anticuerpo unido a la nanocaja a través de la biomolécula.

52. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42 ó 48 a 50, donde la nanocaja además contienen una molécula fluorescente.

53. Sistema según la reivindicación 52, donde la molécula fluorescente es ficocianina.

54. Uso del sistema según cualquiera de las reivindicaciones 52 o 53, para inmunomarcaje fluorescente.

55. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42 ó 48 a 50, que además comprende la incorporación de un principio activo.

56. Sistema según la reivindicación 55, donde el principio activo es actinomicida D.

57. Uso de los sistemas según cualquiera de las reivindicaciones 55 ó 56 en la elaboración de una composición farmacéutica.

58. Uso de los sistemas según cualquiera de las reivindicaciones 55 ó 56, para el transporte dirigido de fármacos.