Epítopos terapéuticos y sus usos.

Un peptido aislado que comprende al menos un epitopo de linfocito T,

en el que el peptido tiene una longitud no superior a 50 aminoacidos y el epitopo de linfocitos T comprende una secuencia seleccionada entre FPQPQQPFP y una secuencia que se puede obtener mediante la desamidacion por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP

Epítopos terapéuticos y sus usos

La invención se refiere a epítopos útiles en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad celíaca, incluyendo diagnóstico, tratamiento, kits, y métodos de uso de lo anterior.

Una reacción inmunológica a la gliadina (un componente del gluten) en la dieta provoca la enfermedad celíaca. Es sabido que las respuestas inmunitarias en el tejido intestinal responden preferentemente a la gliadina que ha sido 1 modificada por una transglutaminasa intestinal. La enfermedad celíaca se diagnostica mediante la detección de anticuerpos dirigidos contra el endomisio, pero esto requiere confirmación mediante el hallazgo de inflamación linfocítica en biopsias intestinales. La obtención de dicha biopsia es un inconveniente para el paciente.

Los investigadores hasta ahora han asumido que únicamente las respuestas de los linfocitos T intestinales 15 proporcionan una indicación precisa de la respuesta inmunitaria contra aliadinas. Por tanto, se han concentrado en la investigación de las respuestas de los linfocitos T en tejido intestinal^ Se conocen2 los epítopos de gliadina que requieren la modificación por transglutaminasa (antes de que sean reconocidos por el sistema inmunitario).

Los inventores han encontrado el epítopo inmunodominante de A-gliadina para linfocitos T reconocido por el sistema 2 inmunitario en la enfermedad celíaca, y han demostrado que es reconocido por los linfocitos T en la sangre periférica de individuos con enfermedad celíaca (véase, documento WO 1/25793). Se ha comprobado que dichos linfocitos T están presentes con una frecuencia suficientemente alta para ser detectables sin reestimulación (es decir, se podría usar un sistema de detección de "respuesta primaria"). El epítopo se identificó usando un método basado en la clonación de células no T que proporciona un reflejo más preciso de los epítopos reconocidos. El epítopo 25 inmunodominante requiere la modificación por transglutaminasa (provocando la sustitución de una glutamina particular por glutamato) antes del reconocimiento por el sistema inmunitario.

En base a este trabajo, los inventores han desarrollado un ensayo que se puede usar para diagnosticar la enfermedad celíaca en una fase temprana. El ensayo se puede llevar a cabo sobre una muestra de sangre periférica 3 y por tanto no es necesaria una biopsia intestinal. El ensayo es más sensible que los ensayos con anticuerpos que se usan en la actualidad.

Mediante el mapeo integral de los epítopos de gliadina de trigo para linfocitos T (véase Ejemplo 13), los inventores también han encontrado epítopos bioactivos en la enfermedad celíaca en pacientes HLA-DQ2+ en otras gliadinas de 35 trigo, que tienen secuencias centrales similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 18-22) y secuencias de longitud completa similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 31-36), al igual que en secalinas de centeno y hordeínas de cebada (por ejemplo, SEQ ID NO: 39-41); véase también las Tablas 2 y 21. Además, se han identificado varios epítopos bioactivos en la enfermedad celíaca en pacientes HLA-DQ8+ (por ejemplo, SEQ ID NO: 42-44, 46). Este mapeo integral proporciona de esta forma los epítopos dominantes reconocidos por los linfocitos T en pacientes celíacos. 4 Los métodos de la invención descritos en este documento se pueden llevar a cabo usando el epítopo adicional identificado que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia SEQ ID NO: 19. Es decir, los agentes de la invención involucran este nuevo epítopo.

La invención también proporciona el uso del agente para la preparación de un medio diagnóstico para su uso en un método de diagnosis de la enfermedad celíaca, o de susceptibilidad a la enfermedad celíaca, en un individuo, dicho método que comprende la determinación de si los linfocitos T del paciente reconocen el agente, dónde el reconocimiento por parte de los linfocitos T indica que el paciente tiene, o es susceptible a, la enfermedad celíaca.

El hallazgo de un epítopo inmunodominante que es modificado por la transglutaminasa (así como los otros epítopos adicionales definidos en este documento) también permite el diagnóstico de la enfermedad celíaca en base a la determinación de si hay presentes otros tipos de respuestas inmunitarias a este epítopo. Así, la invención también proporciona un método de diagnóstico de la enfermedad celíaca, o de susceptibilidad a la enfermedad celíaca en un individuo, que comprende la determinación de la presencia de un anticuerpo que se une al epítopo en una muestra 55 procedente del individuo, donde la presencia del anticuerpo indica que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celíaca.

La invención además proporciona el agente, opcionalmente asociado a un vehículo, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad celíaca mediante la inducción de tolerancia de los linfocitos T que

reconocen el agente. Además se proporciona el agente para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad celíaca en un individuo mediante la inducción de tolerancia del individuo para prevenir la producción de dicho anticuerpo.

La invención proporciona un método para determinar si una composición es capaz de provocar la enfermedad celíaca, que comprende la determinación de si hay presente en la composición una proteína que se pueda modificar mediante una transglutaminasa en una secuencia de oligopéptidos como se ha definido anteriormente, donde la presencia de la proteína indica que la composición es capaz de provocar la enfermedad celíaca.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un péptido aislado que comprende al menos un epítopo para linfocitos T, en el que el epítopo tiene una longitud no superior a 5 aminoácidos y el epítopo para linfocitos T comprende una secuencia seleccionada entre FPQPQQPFP y una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por 15 una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP (el "péptido de la invención").

La presente invención también proporciona un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, para su uso en un método de tratamiento.

La presente invención también proporciona una composición que comprende (a) un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, y (b) un segundo agente que es un péptido que comprende al menos un epítopo que contiene una secuencia seleccionada entre PQPELPY y QLQPFPQPELPYPQPQS.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un primer agente restringido a HLA- DQ2 y un segundo agente restringido a HLA-DQ8, en donde la composición comprende un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un agente que contiene un epítopo de trigo y un agente que contiene un epítopo de centeno, en donde la composición comprende un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un agente que contiene un epítopo de trigo y un agente que contiene un epítopo de cebada, en donde la composición comprende un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un agente que contiene un epítopo de centeno y un agente que contiene un epítopo de cebada, en donde la composición comprende un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un agente que contiene un epítopo de trigo, un agente que contiene un epítopo de cebada, y un agente que contiene un epítopo de centeno, en donde la composición comprende un péptido de la invención, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por una transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

La presente invención proporciona adicionalmente un péptido de la invención,... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado que comprende al menos un epítopo de linfocito T, en el que el péptido tiene una longitud no superior a 5 aminoácidos y el epítopo de linfocitos T comprende una secuencia seleccionada entre FPQPQQPFP y una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia FPQPEQPFP.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido tiene una longitud de 1-5 aminoácidos.

4. El péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que comprende una secuencia seleccionada entre QQPFPQPQQPFP y una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de de la secuencia QQPFPQPQQPFP, y en el que opcionalmente hay presente una modificación en el extremo N terminal.

5. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que consiste en una secuencia seleccionada entre QQPFPQPQQPFPWQP o una secuencia que se puede obtener por desamidación por transglutaminasa de la secuencia QQPFPQPQQPFPWQP, y en el que opcionalmente hay presente una modificación en el extremo N terminal.

6. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que hay presente una modificación en el extremo N terminal.

7. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que hay presente una modificación en el extremo C terminal.

8. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dichas modificaciones son modificaciones post-traduccionales naturales.

9. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que está restringido a HLA-DQ2.

1. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que está restringido a HLA- DQ8.

11. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende un epítopo de trigo.

12. El péptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende un epítopo de trigo, un epítopo de cebada, y un epítopo de centeno.

13. Un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, para su uso en un método de tratamiento.

14. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende la secuencia FPQPEQPFP.

15. Una composición que comprende (a) un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, y (b) un segundo agente que es un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende un secuencia seleccionada entre PQPELPY y QLQPFPQPELPYPQPQS.

16. Una composición que comprende un primer agente restringido a FILA-DQ2 y un segundo agente restringido a FILA-DQ8, en la que la composición comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

17. Una composición que comprende un agente que comprende un epítopo de trigo y un agente que

comprende un epítopo de centeno, en la que la composición comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

18. Una composición que comprende un agente que comprende un epítopo de trigo y un agente que comprende un epítopo de cebada, en la que la composición comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

19. Una composición que comprende un agente que comprende un epítopo de centeno y un agente que comprende un epítopo de cebada, en la que la composición comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

2. Una composición que comprende un agente que comprende un epítopo de trigo, un agente que comprende un epítopo de cebada, y un agente que comprende un epítopo de centeno, en la que la composición comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP.

21. El péptido como se define en la reivindicación 13 para su uso en la inducción de tolerancia de un individuo a una proteína gliadina para suprimir la producción de una respuesta de linfocitos T a un péptido según se define en la reivindicación 13.

22. El péptido como se define en la reivindicación 13 para uso en el tratamiento o prevención de la enfermedad celíaca.

23. Una composición farmacéutica que comprende: (a) un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP; (b) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable; y, opcionalmente, (c) un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende una secuencia seleccionada entre PQPELPY y QLQPFPQPELPYPQPQS.

24. Un método de diagnóstico de la enfermedad celíaca, o susceptibilidad a la enfermedad celíaca, en un individuo, que comprende:

(a) contactar una muestra procedente del hospedador con al menos un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, y opcionalmente, además, un péptido que comprende al menos un epítopo que contiene una secuencia seleccionada entre PQPELPY y QLQPFPQPELPYPQPQS;

(b) determinar in vitro si los linfocitos T de la muestra reconocen el péptido; donde el reconocimiento por los linfocitos T indica que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celíaca.

25. Uso de un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, para la preparación de un medio diagnóstico para su uso en un método de diagnosis de la enfermedad celíaca o de susceptibilidad a la enfermedad celíaca en un individuo, dicho método que comprende la determinación de si los linfocitos T del individuo reconocen el péptido, donde el reconocimiento por los linfocitos T indica que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celíaca.

26. Un método o uso de acuerdo con las reivindicaciones 24 ó 25 en el que el péptido se une a (a) una molécula de HLA, o (b) un fragmento de una molécula de HLA capaz de unirse al péptido.

27. Un método o uso de acuerdo con la reivindicación 26 en el que la molécula o fragmento de HLA está en un complejo que comprende cuatro moléculas de HLA o fragmentos de moléculas de HLA.

28. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 25, 26 ó 27 en el que el método comprende la administración del péptido a la piel de un individuo y la detección de la presencia de inflamación en el sitio de administración, donde la detección de inflamación indica que los linfocitos T del individuo reconocen el péptido.

29. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 24, 26 ó 27 en el que la muestra es una muestra de sangre.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 24, 26, 27 ó 29 en el que los linfocitos T no se vuelven a estimular de manera específica in vitro con el antígeno antes de dicha determinación.

31. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24-3 en el que el reconocimiento del péptido por los linfocitos T se determina detectando la secreción de una citoquina de los linfocitos T.

32. Un método o uso de acuerdo con la reivindicación 31 en el que la citoquina es IFN-y.

33. Un método o uso de acuerdo con la reivindicación 31 o la reivindicación 32 en el que se detecta la citoquina al permitir que la citoquina se una a un anticuerpo inmovilizado específico para la citoquina y a continuación la detección de la presencia del complejo de anticuerpo/citoquina.

34. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 3 en el que dicha determinación se realiza midiendo si el péptido se une al receptor de linfocitos T.

35. Un método para la identificación de un análogo, donde el análogo es un péptido de la invención como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, unido a una molécula de HLA o a un fragmento de una molécula de HLA como se define en las reivindicaciones 26 ó 27, donde el método comprende la determinación de si una sustancia candidata es reconocida por un receptor de los linfocitos T que reconoce un epítopo que comprende una secuencia que se puede obtener mediante desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, donde el reconocimiento de la sustancia indica que la sustancia es un análogo.

36. Un método para la determinación de si una composición es capaz de provocar la enfermedad celíaca, que comprende la determinación de si hay presente en la composición una proteína que comprende una secuencia de oligopéptidos seleccionada entre FPQPQQPFP, QQPFPQPQQPFP y QQPFPQPQQPFP, donde la presencia de la proteína indica que la composición es capaz de provocar la enfermedad celíaca.

37. Un método de acuerdo con la reivindicación 36 en el que dicha determinación se realiza poniendo en contacto la composición con un anticuerpo específico para dicha secuencia de oligopéptidos, donde la unión del anticuerpo a una proteína en la composición indica que la composición es capaz de provocar la enfermedad celíaca.

38. Un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia seleccionada entre FPQPQQPFP, QQPFPQPQQPFP y QQPFPQPQQPFPWQP.

39. Un kit para llevar a cabo un método o uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, que comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el péptido comprende una secuencia que se puede obtener mediante la desamidación por transglutaminasa de la secuencia FPQPQQPFP, y un medio para detectar el reconocimiento del péptido por el linfocito T.

4. Un kit de acuerdo con la reivindicación 39 en el que los medios para detectar el reconocimiento comprende un anticuerpo dirigido contra IFN-y.

41. Un kit de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre un soporte sólido y, opcionalmente, el kit también comprende un medio para detectar el complejo anticuerpo/IFN-y.

42. Uso de un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para producir un anticuerpo específico para el péptido.