COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA DETECTAR EL VIRUS DE LA HEPATITIS B.

Composiciones y métodos para detectar el virus de la hepatitis B Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a kits de diagnóstico para detectar los ácido nucleicos del virus de la hepatitis B y opcionalmente del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y del virus de la hepatitis C. Fundamento de la invención La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) está mundialmente extendida y es causa importante de la hepatitis viral tanto aguda como crónica. El VHB es un virus de DNA circular parcialmente bicatenario que tienen un tamaño de la partícula viral de 42 nm. Esta partícula incluye un revestimiento lipoproteínico exterior y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). El HBsAg circula en la sangre unido a partículas virales o como proteína libre no infecciosa, agregada a partículas esféricas y tubulares, de 22 nm. La transmisión del VHB se realiza principalmente por contacto sanguíneo y/o sexual. El periodo de incubación de este virus puede ser de hasta 180 días (Gitlin, Clin. Chem. 43:1500 (1997)). El HBsAg, que puede ser detectado de 2 a 12 semanas después de una infección con VHB, es el primer marcador serológico de una infección por VHB. La presencia de este marcador precede con frecuencia en 6-8 semanas a los síntomas o anomalías de la bioquímica hepática. Los anticuerpos específicos del antígeno del núcleo de la hepatitis B, que está contenido en la partícula viral, aparecen generalmente 2 semanas después de la detección del HBsAg y permanecen detectables hasta 6 meses después del inicio de la hepatitis aguda (Gitlin, Supra). El riesgo de transmisión del virus de la hepatitis por transfusiones ha disminuido drásticamente desde 1940 en que fue reconocida por primera vez la hepatitis postransfusional (HPT). Por ejemplo, en 1970 los científicos del NIH (National Institute of Health) publicaron los resultados de un estudio prospectivo para determinar la incidencia de la hepatitis ictérica y anictérica en pacientes que habían sido operados a corazón abierto y recibido sangre de donantes de sangre comerciales o voluntarios. Se desarrolló una hepatitis ictérica y anictérica en el 51% de los receptores de sangre comercial, pero en ninguno de los pacientes que recibieron sangre de donantes voluntarios. En 1970 se reveló también en una Conferencia del NIH que el antígeno "Australia" (conocido ahora como el antígeno de superficie de la hepatitis B) formaba parte de un agente infeccioso, presumiblemente un virus de la hepatitis. Solo un par de años más tarde, la exclusión simultánea de donantes de sangre comerciales y de donantes positivos al HBsAg redujo la incidencia de la HPT aproximadamente un 7% de la tasa anterior (Tobler et al., Clin. Chem. 43:1487 (1997)). Estas medidas mejoraron espectacularmente la seguridad del suministro de sangre donada. Más recientemente se ha implementado el análisis de ácidos nucleicos para aumentar la sensibilidad de los ensayos, garantizando con ello un nivel incluso mayor de seguridad en el suministro de sangre donada. Ensayos y reactivos para detectar el VHB han sido descritos anteriormente en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.780.219 y 4.562.159; y en las Solicitudes de Patente Internacional publicadas Nº WO94/08032 y WO95/02690. El documento WO01/77317 describe generalmente el uso de cuatro cebadores para la amplificación del VHB. Sumario de la invención La invención se refiere a un kit para amplificar los ácidos nucleicos dianas del VHB que pueden estar presentes en una muestra biológica, que comprende: un primer cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 26, que compren- den opcionalmente en su extremo 5' una primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es comple- mentaria de los ácidos nucleicos del VHB; un segundo cebador que consiste en la SEQ ID NO: 23, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una segunda secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; un tercer cebador que consiste en la SEQ ID NO: 15, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una terce- ra secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; y un cuarto cebador que consiste en la SEQ ID NO: 11, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una cuarta secuencia de cebador hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB. En una realización muy preferida de esta invención, el kit incluye además al menos una sonda marcada detectablemente que se hibrida con un amplicón del VHB que se produce en una reacción de amplificación realizada utilizando el ce- bador de la primera cadena y el cebador de la segunda cadena. La sonda marcada detectablemente puede incluir la secuencia SEQ ID NO:50 o su complemento, la SEQ ID NO:57 o su complemento o la SEQ ID NO:55 o su complemento. En una realización alternativa, la sonda marcada detectablemente es una baliza molecular que incluye una secuencia de nucleótidos con forma de bucle complementaria de la diana. Esta secuencia de nucleótidos con forma de bucle complementaria de la diana consiste típicamente en 12-20 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia SEQ ID NO:126 o su complemento, teniendo en cuenta la presencia de análogos de nucleótidos y bases equivalentes de RNA y DNA. El kit incluye además tanto un cebador adicional de la primera cadena como un cebador adicional de la segunda cadena. En este kit la secuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la primera cade- 2   na incluye la SEQ ID NO:22, en donde el cebador adicional de la primera cadena incluye la SEQ ID NO:23, en donde la secuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la segunda cadena incluye la SEQ ID NO:15 y en donde el cebador adicional de la segunda cadena incluye la SEQ ID NO:11. En una realización muy preferida de este kit, está incluida además una seudodiana del VHB que está constituida por RNA. En otra realización la se- cuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la primera cadena puede incluir la SEQ ID NO:23, el cebador adicional de la primera cadena puede incluir la SEQ ID NO:26, la secuencia situada hacia el extremo 3 complementaria de el VHB del cebador de la segunda cadena puede incluir la SEQ ID NO:15 y el cebador adicional de la segunda cadena puede incluir la SEQ ID NO:11. En términos generales, los kits de acuerdo con la invención pueden incluir además uno o ambos cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VIH-1 y cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VHC. Definiciones Las siguientes expresiones tienen los siguientes significados para los fines de esta descripción, salvo si se indica expresamente lo contrario. Como se usa en la presente memoria, una "muestra biológica" es cualquier tejido o material que contiene polinucleótidos obtenido de un ser humano Las muestras biológicas de acuerdo con la invención incluyen sangre periférica, plasma, suero, médula ósea, tejido de biopsias incluyendo ganglios linfáticos, tejido o exudados de las vías respiratorias, tejido gastrointestinal, muestras de exudados cervicales, semen u otros líquidos, tejidos o materiales corporales. Una muestra biológica se puede tratar para romper el tejido o la estructura celular, liberando con ello los componentes intracelulares en una solución que puede contener enzimas, tampones, sales, detergentes y similares. Como se usa en la presente memoria, "polinucleótido" significa RNA o DNA, junto con análogos sintéticos de nucleótidos u otras moléculas que pueden estar presentes en la secuencia y que no impiden la hibridación del polinucleótido con una segunda molécula que tiene una secuencia complementaria. El término incluye polímeros que contienen análogos de nucleótidos que existen en la naturaleza y particularmente incluye análogos que tienen un grupo metoxi en la posición 2' de la ribosa (OMe). Como se usa en la presente memoria, una "marcador detectable" es una especie química que puede ser detectada o puede conducir a una respuesta detectable. Los marcadores detectables de acuerdo con la invención se pueden unir a sondas polinucleotídicas directa o indirectamente e incluyen radioisótopos, enzimas, haptenos, cromóforos, tales como colorantes o partículas que imparten un color detectable (por ejemplo, perlas de látex o partículas metálicas), compuestos luminiscentes (por ejemplo, restos bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes. Un "marcador detectable homogéneo" se refiere a un marcador que puede ser detectado de manera homogénea determinando si el marcador está sobre una sonda hibridada con una secuencia diana. Es decir,... 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1. Un kit para amplificar ácidos nucleicos dianas del VHB que pueden estar presentes en un muestra biológica, que comprende: un primer cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 26, que compren- den opcionalmente en su extremo 5 una primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5 que no es comple- mentaria de los ácidos nucleicos del VHB; un segundo cebador que consiste en la SEQ ID NO: 23, que comprende opcionalmente en su extremo 5 una segunda secuencia de cebador situada hacia el extremo 5 que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; un tercer cebador que consiste en la SEQ ID NO: 15, que comprende opcionalmente en su extremo 5 una terce- ra secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; y un cuarto cebador que consiste en la SEQ ID NO: 11, que comprende opcionalmente en su extremo 5 una cuarta secuencia de cebador hacia el extremo 5 que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB. 2. El kit de la reivindicación 1, en donde el primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 22, que comprende opcionalmente en su extremo 5 dicha primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5. 3. El kit de la reivindicación 2, que comprende además una seudodiana del VHB que comprende RNA. 4. El kit de la reivindicación 1, en donde el primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 26, que comprende opcionalmente en su extremo 5 dicha primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5. 5. El kit de las reivindicaciones 2 o 4, en donde dicho primer cebador comprende la primera secuencia opcional de cebador situada hacia el extremo 5, en donde el segundo cebador comprende la segunda secuencia opcional de cebador situada hacia el extremo 5, y en donde cada una de las primera y segunda secuencias de cebador situadas hacia el extremo 5 es una secuencia de promotor para una RNA-polimerasa. 6. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende además al menos una sonda marcada detectablemente complementaria de un amplicón de VHB producido en una reacción de amplificación in vitro usando dichos cebadores. te.   7. El kit de la reivindicación 6, en donde la sonda marcada detectablemente comprende un marcador fluorescen- 8. El kit de las reivindicaciones 6 o 7, en donde dicha sonda marcada detectablemente es una baliza molecular. 9. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, que comprende además cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VIH-1. 10. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, que comprende además cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VHC. 11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además un oligonucleótido de captura de diana. 12. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho kit es para una amplificación mediada por transcripción de un ácido nucleico diana del VHB de una muestra biológica. 67