MÉTODO PARA TIPAR Y DETECTAR HBV.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION Y/O ANALISIS GENETICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) EN UNA MUESTRA BIOLOGICA,

QUE COMPRENDE HIBRIDIZAR LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DE LA MUESTRA CON UNA COMBINACION DE AL MENOS DOS SONDAS DE NUCLEOTIDOS, HIBRIDIZANDO CONCRETAMENTE DICHA COMBINACION A UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION GENETICA DE LA MEZCLA RT DEL VHB Y/O UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION PRE - NUCLEO DEL VHB Y/O A UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION HBSAG DEL VHB Y/O A UNA SECUENCIA BLANCO ESPECIFICA DEL GENOTIPO DEL VHB, ELIGIENDOSE DICHAS SECUENCIAS - BLANCO EN LA FIGURA 1, Y APLICANDOSE DICHAS SONDAS A LUGARES CONOCIDOS, SOBRE SOPORTE SOLIDO, Y SIENDO DICHAS SONDAS CAPACES DE HIBRIDIZARSE A LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DE LA MUESTRA EN LAS MISMAS CONDICIONES DE HIBRIDIZACION Y LAVADO, O HIBRIZANDOSE DICHAS SONDAS ESPECIFICAMENTE, CON UNA SECUENCIA COMPLEMENTARIA, A CUALQUIERA DE DICHAS SECUENCIAS BLANCO, O UNASECUENCIA EN LA QUE LA T DE DICHA SECUENCIA BLANCO ES SUSTITUIDA POR U; Y DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS; Y DEDUCIR EL GENOTIPO Y/O MUTANTE DEL VHB PRESENTE EN DICHA MUESTRA A PARTIR DE LA SEÑAL O SEÑALES DIFERENCIALES DE HIBRIDIZACION OBTENIDAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A CONJUNTOS DE SONDAS DE NUCLEOTIDOS Y POSIBLEMENTE CEBADORES UTILES EN DICHOS PROCEDIMIENTOS, ASI COMO A SU USO EN UN PROCEDIMIENTO PARA TIPIFICAR Y/O DETECTAR EL VHB Y PARA ENSAYAR KITS QUE UTILIZAN EL MISMO

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico del virus de la hepatitis B (HBV). Más particular-mente, la presente invención se refiere al campo del genotipado de HBV y la determinación de la presencia de mutantes de HBV en muestras de ensayo. 5

La presente invención se refiere particularmente a un método para la detección rápida y fiable de mutantes y genotipos de HBV que aparecen en una muestra de ensayo usando conjuntos específicos de sondas optimizadas para funcionar juntas en un ensayo de hibridación inversa.

El virus de la hepatitis B es un virus de ADN encapsulado pequeño, de una longitud de aproximadamente 3200 pb. Históricamente, se ha caracterizado en base a la reacción inmunológica del HBsAg con conjuntos de anticuer-10 pos monoclonales. Los aislados se describieron como a, que indica el determinante común para todos los subtipos diferentes, seguido de las combinaciones específicas de los subtipos: dw, dr, yw, o yr. Estos últimos son pares de de-terminantes mutuamente excluyentes, que cubren los aminoácidos 122 (d = lys, y = arg) y 160 (w = lys, r = arg) de HBsAg. Existen varios subdeterminantes para w, y se pueden adscribir a la aparición de ciertas variantes de aminoáci-dos en el codón 127. Más recientemente, se ha propuesto una clasificación genética, basada en el análisis molecular 15 del virus. Este tipo de análisis mostró que en total existen seis genotipos diferentes, indicados desde A a F, con una divergencia genética máxima de 8% cuando se comparan genomas completos (repasado por Magnius y Norder, 1995).

La variabilidad genética de HBV puede ser clínicamente importante. De hecho, la variabilidad genómica puede incluir algunos mecanismos mediante los cuales el HBV evita el aclaramiento inmunitario, y por tanto induce infección crónica. Un marcador proteico importante a la hora de inducir tolerancia inmunitaria, eliminación del virus e infección 20 crónica, es HBeAg. La expresión de esta proteína está estrictamente controlada tanto a nivel transcripcional como tra-duccional (Li et al., 1993; Okamoto et al., 1990; Yuan et al., 1995; Sato et al., 1995). Por lo tanto, en el transcurso natu-ral de la infección por HBV, una etapa bien caracterizada de la enfermedad se indica como hepatitis B crónica negativa a HBe (repasado por Hadziyannis S.J., 1995). Esta fase es debida principalmente a la aparición de mutaciones de co-dones de parada traduccionales preCore. La variabilidad genética global determina la frecuencia y localización física en 25 el genoma vírico en el que aparecen estas mutaciones de codones de parada traduccionales. Se propuso que la regula-ción transcripcional es el mecanismo para el genotipo A (y posiblemente también F), mientras que el control traduccional era encontrado más probablemente en otros genotipos (Li et al.; 1993; Sato et al., 1995). Contradictorio con la regula-ción traduccional, se encontró que la regulación transcripcional fue incapaz de bloquear completamente la expresión de HBeAg, y por lo tanto se propuso categorizar el fenotipo de este mutante como HBe suprimido, en lugar de negativo a 30 HBe (Takahashi et al., 1995). En cualquier caso, estos mutantes preCore conducirían a una destrucción del balance preexistente entre HBeAg en circulación y los péptidos derivados de HBc presentados por moléculas HLA de clase I sobre la superficie de hepatocitos infectados, disminuyendo de ese modo el efecto supresor de HBeAg en células T, dando finalmente como resultado la liberación parcial de CTL específicos del núcleo y conduciendo a apoptosis de los hepatocitos infectados. En general, tras la aparición de las variantes HBe-, el transcurso de la infección vírica se carac-35 teriza por la progresión de hepatitis crónica, lo que puede conducir al desarrollo de cirrosis y carcinoma hepatocelular (Hadziyannis, 1995).

Otro aspecto para el cual la variabilidad genética o genotipado del virus puede ser de importancia es en el desarrollo de vacunas en las que la respuesta puede estar mediada por el tipo de virus. La protección frente a la infec-ción por HBV de todos los subtipos es conferida por anticuerpos frente al determinante “a” común del antígeno de super-40 ficie de la HB (HBsAg). Se ha demostrado que este determinante “a” presenta un número de epítopos, y que esta es-tructura terciaria es tremendamente importante para su antigenicidad. La región más importante está entre los aminoá-cidos 124 y 147, pero se puede extender desde el aminoácido 114 a 150. Una respuesta anti-HBs adecuada, formada tras la vacunación, es en principio completamente protectora. La infección con una cepa de HBV que posee mutaciones en la región del determinante “a” puede dar como resultado el fracaso de la vacuna, debido a que la respuesta inmunita-45 ria humoral inducida por la vacuna no reconoce al mutante HBsAg. Los mutantes de escape asociados con la vacuna más comunes son las sustituciones de una glicina en la posición 145 por una arginina (G145R), K141E, y T126N. Pero también se ha encontrado una inserción de 2 aa entre las posiciones de los aa 122 y 123, una inserción de 8 aa entre los aa 123 y 124 (Carman et al., 1990, 1995; Crawford, 1990; Waters et al., 1992).

La lamivudina es un (-)-enantiómero de 3'-tiacitidina, un análogo 2',3'-didesoxinucleosídico, y se sabe que es 50 un potente inhibidor de la replicación de HBV a través de la inhibición de la actividad de transcriptasa inversa (RT) de la HBV polimerasa. El tratamiento con lamivudina puede dar como resultado mejoras histológicas en pacientes con hepati-tis crónica, y, cuando se administra antes y después de un transplante de hígado, puede evitar la reinfección del injerto (Honkoop et al., 1995; Naoumov et al., 1995). Sin embargo, después del tratamiento, se puede observar un rebrote de la hepatitis en la mayoría de los pacientes, con elevaciones de ALT y ADN de HBV que vuelve a ser detectable. Este rebo-55 te del ADN de HBV está asociado con un nuevo cuasi equilibrio de las especies. En unos pocos casos, se observó el avance repentino del virus durante la terapia, debido a la selección de cepas de HBV resistentes a lamivudina. La natu-

raleza exacta de este avance repentino se ha adscrito a la acumulación de mutaciones en la parte de RT de la polime-rasa. Se ha encontrado un mecanismo similar en la RT polimerasa del HIV, en el que, al tratar con lamivudina, las muta-ciones se acumulan en el motivo YMDD (Gao et al., 1993). Este motivo YMDD también está presente en la parte de RT de la HBV polimerasa, y se han encontrado en esta región mutaciones seleccionadas por lamivudina en HBV (Tipples et al., 1996), así como en otras regiones de la parte de RT de la polimerasa (Ling et al., 1996). Otro fármaco que ha de-5 mostrado que inhibe la actividad de transcriptasa inversa de la HBV polimerasa es el penciclovir (Shaw et al., 1996), y también se pueden detectar mutaciones en la HBV polimerasa con el tratamiento con este fármaco.

En la Solicitud de Patente Internacional WO 93/13120, se ha descrito un método para la detección de HBV en una muestra en un ensayo de hibridación en sándwich en fase de disolución. En la Solicitud de Patente Internacional WO 95/02690, se proporciona una composición de sondas de HBV y la determinación del mismo presente en la muestra 10 de ensayo. En la patente EP 229701, se ha descrito un procedimiento de PCR general para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico en un virus.

A partir de todo esto, se puede concluir que la información en los siguientes aspectos es esencial para un diagnóstico in vitro apropiado, monitorización y seguimiento de infecciones por HBV:

- genotipo; 15

- mutaciones preCore;

- mutaciones de escape de vacuna;

- mutaciones del gen de RT seleccionadas mediante tratamiento con fármacos tales como lamivudina y penciclo-vir.

La obtención de toda esta información usando las tecnologías existentes es complicada, consume tiempo, y 20 requiere un personal altamente cualificado y experimentado.

De este modo, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación de la presencia o ausencia de uno o más genotipos de HBV presentes posiblemente en una muestra biológica.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable 25 para la determinación de la presencia o ausencia de una o más variaciones en la región de HBsAg que representan uno o más genotipos de HBV presentes posiblemente en una muestra biológica,...

1. Un método para la detección de tanto genotipos de cepas de HBV como de mutantes de HBV re-sistentes a fármacos, en una muestra biológica, que comprende:

(i) si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) si es necesario, amplificar la parte relevante de un gen de HBV adecuado presente en dicha muestra con al 5 menos un par de cebadores adecuados;

(iii) hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con una combinación de al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos:

- SEC ID 77, 81, 139-141, 190-194

- SEC ID 78, 142-147, 149 10

- SEC ID 79, 150-161, 204

- SEC ID 82, 162-169, 208

- SEC ID 170-176, 213

- SEC ID 178-189, 214-219,

- opcionalmente una o más de SEC ID 80, 148 y 177, y al menos una sonda procedente de cada uno de los 15 siguientes grupos:

- SEC ID 114, 115, 127-129, 227-234, 243, 249, 250, 261

- SEC ID 116, 117, 130-133, 244-248, 251-260, 262-266, y/o al menos una sonda procedente de:

- SEC ID 267 y 269, cada una junto con SEC ID 268,

(iv) detectar los híbridos formados en la etapa (iii); 20

(v) inferir los genotipos de HBV y los mutantes de HBV resistentes a fármacos presentes en dicha muestra a par-tir de la señal o señales de hibridación diferenciales obtenidas en la etapa (iv).

2. Método según la reivindicación 1, en el que las sondas oligonucleotídicas de la etapa (iii) se carac-terizan porque detectan específicamente mutaciones de resistencia a fármacos en el motivo YMDD, siendo dichas son-das 25

- SEQ ID 77, 140 y 193,

- SEQ ID 78,

- SEQ ID 153, 154 y 204,

- SEQ ID 165 y 208,

- SEQ ID 172 y 213, 30

- SEQ ID 186, 216 y 219,

- SEQ ID 80 y 177,

- SEQ ID 115 y 127,

- SEQ ID 116 y 132.

3. Un kit de ensayo para la detección de tanto genotipos de cepas de HBV como mutantes de HBV 35 resistentes a fármacos presentes en una muestra biológica según el método de la reivindicación 1, que comprende los siguientes componentes:

(i) cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) cuando sea apropiado, al menos un par de cebadores adecuado; 40

(iii) al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos:

- SEQ ID 77, 81, 139-141, 190-194

- SEQ ID 78, 142-147, 149

- SEQ ID 79, 150-161, 204

- SEQ ID 82, 162-169, 208

- SEQ ID 170-176, 213

- SEQ ID 178-189, 214-219,

- opcionalmente una o más de SEQ ID 80, 148 y 177, y al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos: 5

- SEQ ID 114, 115, 127-129, 227-234, 243, 249, 250, 261

- SEQ ID 116, 117, 130-133, 244-248, 251-260, 262-266, y/o al menos una sonda de:

- SEQ ID 267 y 269, cada una junto con SEQ ID 268, posiblemente fijada a un soporte sólido;

(iv) un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;

(v) una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución; 10

(vi) cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación anterior;

(vii) cuando sea apropiado, un medio para unir dicha sonda a una localización conocida sobre un soporte sólido.

4. Un mutante de HBV que comprende una secuencia nucleotídica que contiene una mutación resistente a fármacos en el gen pol de RT de HBV, en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácido en el motivo YMDD de la polimerasa de HBV, en el que dicho cambio de aminoácido es M a V en la posición 552 según se indica en 15 la figura 1.

5. Un método para identificar un mutante de HBV como se define en la reivindicación 4, en una muestra, que comprende:

(i) liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) opcionalmente, amplificar al menos una parte del gen de HBV presente en dicha muestra con al menos un par 20 de cebadores;

(iii) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el gen pol de RT de HBV que da como resultado un cambio de aminoácido en el motivo YMDD de la polimerasa de HBV, en el que dicho cambio de aminoácido es M a V en la posición 552 como se indica en la figura 1, e identificar de ese modo la existencia en dicha muestra de una cepa de HBV resistente a fármacos. 25