Amplificación de ácido nucleico multifásica.

Un método para cuantificar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con un primer oligonucleótido de amplificación que comprende una secuencia específica diana 3' específica para una primera parte de la secuencia de ácido nucleico diana y es capaz de extenderse por una transcriptasa inversa, bajo condiciones que permiten la hibridación del primer oligonucleótido de amplificación con la primera parte de la secuencia de ácido nucleico diana, generando así un híbrido de preamplificación que comprende el primer oligonucleótido de amplificación y la secuencia de ácido nucleico diana, en donde el primer oligonucleótido de amplificación comprende además una secuencia promotora 5' para una ARN polimerasa;

(b) aislar el híbrido de preamplificación de la etapa (a) mediante captura de la diana en un soporte sólido seguido de lavado para eliminar cualquiera de los primeros oligonucleótidos de amplificación que no se hibridaron con la primera parte de la secuencia de ácido nucleico diana en la etapa (a);

(c) amplificar, en una mezcla de reacción de amplificación de primera fase que comprende un segundo oligonucleótido de amplificación, al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico diana del híbrido de preamplificación aislado en la etapa (b) en una reacción de amplificación asociada a transcripción, sustancialmente isotérmica, de primera fase bajo condiciones que permiten la amplificación lineal de la misma, pero no permiten la amplificación exponencial de la misma, dando como resultado así una mezcla de reacción que comprende un primer producto de amplificación,

en donde la reacción de amplificación asociada a transcripción, sustancialmente isotérmica, de primera fase comprende:

(i) en presencia de cada una transcriptasa inversa, una ARN polimerasa y una actividad RNasa H, extender el extremo 3' del primer oligonucleótido de amplificación del híbrido de preamplificación para crear un producto de extensión;

(ii) extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido de amplificación hibridado con una parte del producto de extensión producido en la etapa (i) rellenando así la región promotora del primer oligonucleótido de amplificación para formar un molde de doble cadena que contiene un promotor de doble cadena, en donde el segundo oligonucleótido de amplificación es complementario a una parte de un producto de extensión de la secuencia específica diana 3' del primer oligonucleótido de amplificación;

(iii) proporcionar condiciones que permitan que la ARN polimerasa produzca múltiples transcritos de ARN a partir del molde de doble cadena; y

(iv) proporcionar condiciones que permitan (a) al segundo oligonucleótido de amplificación hibridarse con los transcritos de ARN producidos en la etapa (iii) y se extienda para producir copias de ADNc sin promotor del molde de ácido nucleico diana y (b) que permitan que las cadenas de ARN sean degradadas por la actividad RNasa H,

en donde la mezcla de reacción de amplificación de primera fase no comprende ningún primer oligonucleótido de amplificación además del aislado con el híbrido de preamplificación en la etapa (b), sino que comprende el segundo oligonucleótido de amplificación;

(d) combinar la mezcla de reacción de amplificación de primera fase que comprende el primer producto de amplificación de la etapa (c) con un cebador promotor que se hibrida con el primer producto de amplificación y participa en la amplificación exponencial del primer producto de amplificación, pero que carece de la mezcla de reacción que comprende el primer producto de amplificación, para producir una mezcla de reacción de amplificación de segunda fase,

en donde la mezcla de reacción de amplificación de segunda fase comprende adicionalmente una sonda de hibridación específica de secuencia; y

en donde tanto las mezclas de reacción de amplificación de primera fase como de segunda fase comprenden cada una de una transcriptasa inversa, una ARN polimerasa y una actividad RNasa H;

(e) realizar, en una reacción de amplificación asociada a transcripción, sustancialmente isotérmica, de segunda fase, en la mezcla de reacción de amplificación de segunda fase producida en la etapa (d), una amplificación exponencial del primer producto de amplificación, sintetizando así un segundo producto de amplificación;

(f) detectar, con la sonda de hibridación específica de secuencia a intervalos de tiempo regulares, la síntesis del segundo producto de amplificación en la mezcla de reacción de amplificación de segunda fase; y

(g) cuantificar la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra utilizando los resultados de la etapa (f).