MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DEL HDV, SUS FRAGMENTOS Y SUS APLICACIONES.

Moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por:

- el genoma complete de la variante del HDV denominada dFr45 que presenta la secuencia SEC ID Nº: 1, y - el genoma de una variante del HDV que presenta una divergencia genética ≤ 15% con la secuencia SEC ID Nº: 1

La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos procedentes de nuevas cepas o aislados de virus de la hepatitis D que constituyen genotipos diferentes de los genotipos I, II y III conocidos, a sus fragmentos, a las proteínas correspondientes, así como a sus aplicaciones y a los reactivos de diagnóstico.

La presente invención también se refiere a un método de diagnóstico sensible del virus de la hepatitis D (o virus de la hepatitis delta), así como a un método de seguimiento epidemiológico de infecciones por HDV.

El virus de la hepatitis D (VHD o HDV, por hepatitis Dvirus, en inglés) o delta es un virus satélite de la hepatitis B. Este virus tiene una estructura particular: estructura quimérica asociada a componentes específicos del HDV (ARN viral y proteínas HD), una envoltura que comprende las tres glicoproteínas del HBV: grande (preS1-preS2-S), mediana (preS2-S) y pequeña (S). El diámetro medio de las partículas del HDV se sitúa entre el de las partículas del HBV maduras (partículas de DANE: 42 nm) y el de las envolturas vacías del HBV (formas esféricas o filamentosas: 22 nm) y la densidad de flotación es de 1,24-1,25 g/cm3.

Dentro de los viriones, el ARN del HDV es circular y de polaridad negativa. Esta cadena monocatenaria circular cerrada, el genoma más pequeño conocido de los virus que infectan a mamíferos, tiene un porcentaje elevado de GC (60%).

El ARN del HDV se replica independientemente del HBV, cuya función se limita a proporcionar la envoltura del HDV. Las únicas proteínas encontradas (sHD y LHD) las codifica el ARN antigenómico que, en la célula infectada, es completo, circular y pseudo-bicatenario, sirve de intermediario de la replicación y sostiene la edición.

El ARN del HDV pertenece a un tipo de ribozima específica. La reacción de auto-escisión necesita el ARN y un catión divalente (Mg++). La escisión crea un extremo 2', 3' fosfato cíclico y un extremo 5' hidroxilo.

Las ribozimas delta (genómica y anti-genómica) tienen una configuración secundaria de similar a pseudo-nudos. Las secuencias implicadas incluyen principal o exclusivamente las secuencias situadas en 3' del sitio de auto-escisión (aproximadamente 84 nucleótidos).

Durante el ciclo viral, el ARNm del HDV codifica una proteína que existe en dos formas: una proteína de 194-195 aminoácidos (forma ‘s' que indica pequeña (small)) de 240 kilodaltons (kDa) y una proteína de 214 aminoácidos (forma ‘L' que indica grande (Large)) de 27 kDa, que existen en proporciones variables. Estas proteínas llevan la antigenicidad ‘delta' y se detectan en el hígado o en el suero de pacientes o animales infectados (chimpancé, marmota). Estas dos proteínas virales sHD y LHD comienzan en el primer ATG de la fase de lectura abierta situada en la posición 1598 (según la numeración de Wang et al., 1986 o 1987) del ARN antigenómico. Durante la replicación, en la posición 1012 aparece una mutación, dependiente de una enzima celular, la adenosina desaminasa, dependiente del ARN bicatenario, transformando el codón de terminación ámbar (UAG) en el codón del triptófano (UGG), alargando en dirección 3' la fase de lectura de 19 ó 20 codones y confiriendo a las dos formas sHD y LHD diferentes propiedades.

5 El ARNm acaba en una cola de poli(A), 15 nucleótidos después de la señal de poliadenilación consenso, AAUAAA (posiciones 954-959).

En el ciclo de replicación, las funciones de las proteínas de 24 y 27 Kd se oponen: sHD activa la replicación viral mientras que LHD la reprime y desempeña una función en el ensamblaje de las partículas virales. Estas proteínas se fosforilan en los restos de serina pero no se glicosilan (Tabla I). Están constituidas por dominios funcionales comunes y por un dominio específico en la proteína grande LHD. Tabla I: Resumen y comparación de las funciones de las dos formas p24 y p27

Brevemente, los diferentes dominios de estas dos proteínas son los siguientes:

* dominios comunes

15 -El dominio de polimerización, que comprende la secuencia entre los restos aminoacídicos 13 y 48 formada por una disposición de leucina o isoleucina, organizada en hélice α de tipo “cremallera de leucina” (leucine zipper), implicada en la polimerización de las proteínas, indispensable para (i) la transactivación de la replicación viral por el Ag-sHD, (ii) la inhibición de la replicación por el Ag-LHD y (iii) el ensamblaje de los complejos sHD-LHD en las envolturas del HBV. -La señal de localización nuclear (SLN) que implica dos secuencias de localización nuclear identificadas en la región 67-68, esenciales para translocar el Ag-sHD sintetizado el citoplasma y quizá la ribonucleoproteína después de su entrada en la célula, hacia el núcleo.

- El sitio de fijación al ARN que se basa en dos secuencias ricas en arginina

localizadas entre los restos 97 y 163 que permiten la unión de las proteínas sHD sobre el ARN genómico 25 o antigenómico. Esta fijación es indispensable para que el Ag-sHD active la replicación.

* dominios específicos

Los 19-20 aminoácidos situados en el extremo COOH de la proteína grande tienen una función importante en el ciclo del HDV. En efecto, estos aminoácidos (aa 195-214), intervienen en el ensamblaje de las partículas virales (Chang et al., 1991). Esta actividad podría estar en parte relacionada con la presencia de una cisteína en la posición 211 (Glenn et al., 1992), conservada para todos los genomas virales caracterizados hasta ahora. Esta cisteína, situada 4 aminoácidos delante del extremo COOH de la proteína, forma una caja “CXXX” y fija un grupo farnesilo (Glenn et al., 1992) cadena de 15 carbonos derivada del ácido mevalónico, por acción de una farnesiltransferasa. Esta maduración postraduccional orienta las proteínas hacia las membranas celulares.

Por otro lado, la proteína pequeña y grande se han diferenciado por anticuerpos monoclonales (clon 9E4) (Hwang et Lai, 1993a). Estos anticuerpos sólo reconocen la sHD (Lai et al., 1993). Como la secuencia de aminoácidos de la proteína pequeña se incluye en la grande, estos resultados sugieren una conformación diferente entre sHD y LHD en el seno de los 30 aminoácidos carboxiterminales de la proteína pequeña sHD, lo que sugiere que el epítopo reconocido sobre la sHD debe ocultarse en la LHD en condiciones no desnaturalizantes.

El HDV se transmite sobre todo a través de agujas y sangre contaminadas, por tanto mediante los portadores del HDV o del HBV.

En América del Norte y en Europa del Oeste, la hepatitis D se localiza sobre todo en consumidores de drogas intravenosas, hemofílicos y los que reciben múltiples transfusiones.

La epidemiología y los medios de contaminación se superponen en parte. Se estima globalmente en un 5% la proporción de portadores del Ag-HB infectados por el HDV. Por lo tanto, se han constatado las disparidades de prevalencia geográfica y epidemiológica.

En determinadas regiones del globo, existe una alta prevalencia de esta enfermedad, en los portadores del virus de la hepatitis B, incluyendo la cuenca amazónica de América del Sur, África central, sur de Italia y los países del Oriente Medio.

Alrededor del Mediterráneo, más particularmente en el sur de Italia, Grecia y en Oriente Medio donde la frecuencia del portador crónico del HBV es intermedia (1% al 5%), la infección por HDV es elevada. En estas regiones, se ha sugerido la transmisión intrafamiliar, argumentada por estudios filogenéticos del virus que infecta a miembros de una misma familia (Niro et al., 1999). En el sur de Italia, la prevalencia en el sujeto Ag-HBs positivo disminuye, pasando del 23% en el año 1987 al 8% en el año 2000 (Gaeta et al., 2000).

En África y en Asia, donde el portador crónico del HBV es de frecuencia elevada (del 10% al 20%), así como en América del Sur y en las islas del Pacífico, donde es intermedia (del 1% al 5%), la distribución del HDV es paradójicamente disparatada. En África, los estudios de seroprevalencia muestran una distribución muy heterogénea de...

1. Moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por: -el genoma complete de la variante del HDV denominada dFr45 que presenta la secuencia SEC ID Nº:

1, y -el genoma de una variante del HDV que presenta una divergencia genética ≤ 15% con la secuencia SEC ID Nº: 1.

2. Moléculas de ácido nucleico, caracterizadas por que comprenden al menos uno de los fragmentos de la secuencia de un HDV variante de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionadas del grupo constituido por: a) los fragmentos R0 que presenta la secuencia SEC ID Nº: 48 b) el fragmento R1 que se extiende desde las posiciones 307 a 1289 del genoma del HDV, c) el fragmento R2 que se extiende desde las posiciones 889 a 328 del genoma del HDV, d) el fragmento R3 que se extiende desde las posiciones 1486 a 452 del genoma del HDV, e) el fragmento R'1 que se extiende desde las posiciones 305 a 1161 del genoma del HDV, f) el fragmento R'2 que se extiende desde las posiciones 984 a 331 del genoma del HDV, g) el ADNc que codifica la proteína sHD, de secuencia SEC ID Nº: 4, h) el ADNc que codifica la proteína LHD de secuencia SEC ID Nº: 2, y i) los cebadores de la secuencia SEC ID Nº: 38 y SEC ID Nº: 47

3. Método de detección de un HDV variante tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, por hibridación y/o amplificación, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo método se caracteriza por que comprende:

(1) una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

(2) la realización de al menos una amplificación génica usando un par de cebadores seleccionado en el grupo constituido por los cebadores adecuados para amplificar una de las siguientes regiones del ARN genómico del HDV: R0, R1, R2, R3, R'1 y R'2 y

(3) el análisis del producto amplificado por comparación con la molécula de secuencia SEC ID Nº: 1.

4. Método de detección de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que la etapa

(3) de análisis puede realizar por restricción, secuenciación o hibridación

5. Método de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado por que los cebadores específicos para la amplificación de las regiones R0, R1, R2, R3, R'1 y R'2, usados en la etapa

(2) se seleccionan del grupo constituido por:

- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación de R0 (aproximadamente 400 pb),

- los cebadores 320S (SEC ID Nº: 39) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación del fragmento R1 (aproximadamente 960 pb),

- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45), para la amplificación de R2 (aproximadamente 1100 pb), que contiene el gen sHD correspondiente a las posiciones 1598-950,

- los cebadores 1480S (SEC ID Nº: 46) y 440AS (SEC ID Nº: 47), para la amplificación de R3 (aproximadamente 650 pb),

- los cebadores 318S (SEC ID Nº: 35) y 1150AS (SEC ID Nº: 36), para la amplificación de R'1 (aproximadamente 850 pb),

- los cebadores 960S (SEC ID Nº: 37) y 345AS (SEC ID Nº: 38), para la amplificación de R'2 (aproximadamente 1050 pb),

6. Método de de detección y de genotipado del HDV a partir de una muestra biológica, cuyo método se caracteriza por que comprende:

(a) una etapa de extracción del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus HDV,

(b) una etapa de amplificación de la región R0 delimitada por las posiciones 889 a 1289 del genoma del HDV,

(c) un primer tratamiento de moléculas de ácidos nucleicos amplificadas por las enzimas de restricción Smal y Xhol, para producir un primer conjunto de fragmentos de restricción,

(d) un segundo tratamiento de moléculas de ácidos nucleicos por la enzima de restricción SacII, para producir un segundo conjunto de fragmentos de restricción

(e) el análisis combinado, por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción )), de los dos conjuntos de fragmentos restricción producidos, para detectar la presencia y/o determinar el tipo de HDV presente en dicha muestra biológica.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que la etapa (b) de amplificación, de las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra, por RT-PCR se realiza ventajosamente con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34).

8. Método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado por que también comprende:

(a) la amplificación de las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra por RT-PCR con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45) para amplificar la región R2, y

(b) la secuenciación directa de la región R2 amplificada y la comparación con la molécula de ARN de la secuencia SEC ID Nº: 1

9. Vector recombinante, particularmente un plásmido que comprende un inserto constituido por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. Célula transformada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

11. Productos de traducción codificados por la molécula de ARN de secuencia SEC ID Nº: 1

o por secuencias complementarias sentido o antisentido.

12. Proteínas, caracterizadas por que una de las moléculas de ácido de nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, las codifican.

13. Proteína de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada por que se selecciona del grupo constituido por: -la proteína LHD de dFr45, que presenta la secuencia SEC ID Nº: 3, y -la proteína sHD de dFr45, que presenta la secuencia SEC ID Nº: 5

14. Péptido, caracterizado por que está constituido por un fragmento de una proteína de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, seleccionado del grupo constituido por:

- el péptido A constituido por los 19 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de la secuencia SEC ID Nº: 3,

- el péptido B de secuencia (código de una letra) RLPLLECTPQ (SEC ID Nº: 59) constituido por los 10 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de la secuencia SEC ID Nº: 3, y

- el péptido C constituido por los 9 aminoácidos anteriores a la secuencia SEC ID Nº: 59 (SEC ID Nº: 60)

15. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para la preparación de un kit de detección y genotipado de un HDV.