Análisis de la secuencia de ácidos nucleicos.

Análisis de la secuencia de ácidos nucleicos. Campo de la invención Esta invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la secuencia de un polinucleótido. Antecedentes de la invención La capacidad de determinar la secuencia de un polinucleótido es de gran importancia científica. Por ejemplo, el Proyecto del Genoma Humano es un ambicioso esfuerzo internacional para trazar el mapa y la secuencia de los tres billones de bases de DNA codificadas en el genoma humano. Cuando se complete, la base de datos de la secuencia resultante será una herramienta de poder sin precedentes para la investigación biomédica. El principal obstáculo para una conclusión con éxito de este proyecto tiene que ver con la tecnología usada en el procedimiento de secuenciación. El procedimiento principal de uso general para la secuenciación del DNA a gran escala es el procedimiento de terminación de cadena. Este procedimiento se desarrolló primero por Sanger y Coulson (Sanger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977; 74: 5463-5467), y se basa en el uso de derivados didesoxi de los cuatro trifosfatos de nucleósidos que se incorporan a la cadena polinucleotídica naciente en la reacción de la polimerasa. Tras la incorporación, los derivados didesoxi terminan la reacción de la polimerasa y seguidamente los productos se separan por electroforesis en gel y se analizan para revelar la posición en la que el derivado didesoxi particular se ha incorporado en la cadena. Aunque este procedimiento se usa ampliamente y produce resultados fiables, se reconoce que es lento, laborioso y caro. Un procedimiento de secuenciación alternativo se propone en el documento EP-A-0471732, que utiliza medios espectroscópicos para detectar la incorporación de un nucleótido en la cadena polinucleotídica naciente complementaria al molde. El procedimiento se basa en un complejo inmovilizado de molde y cebador, que se expone a un flujo que contiene solamente uno de los diferentes nucleótidos. Las técnicas espectroscópicas se usan después para medir una señal dependiente del tiempo que se origina del crecimiento de la copia del molde catalizado por la polimerasa. Las técnicas espectroscópicas descritas son espectroscopía de resonancia del plasmón superficial (SPR), que mide los cambios en un analito dentro de un campo de ondas evanescentes, y técnicas de medida de fluorescencia. Sin embargo, se reconoce que este procedimiento tiene limitaciones; lo más grave de la técnica SPR es que, a medida que el tamaño de la cadena copiada crece, el tamaño absoluto de la señal también crece debido al movimiento de la cadena fuera del campo de ondas evanescentes, haciendo más difícil detectar los incrementos. Las técnicas de medida de fluorescencia tienen la desventaja de aumentar la interferencia de fondo de los fluoróforos incorporados en el crecimiento de la cadena polinucleotídica naciente. A medida que la cadena crece, el ruido de fondo aumenta y el tiempo requerido para detectar cada incorporación de nucleótidos necesita incrementarse. Esto restringe gravemente el uso del procedimiento para secuenciar polinucleótidos grandes. Por lo tanto, es necesario un procedimiento mejorado para la determinación de la secuencia de polinucleótidos que incremente significativamente la velocidad a la que un polinucleótido se secuencia y que se lleve a cabo preferiblemente por un proceso automatizado, reduciendo la complejidad y el coste asociados con los procedimientos existentes. Sumario de la invención La presente invención se basa en la verificación de que la medida de una radiación electromagnética u otra puede utilizarse para detectar un cambio de masa y/o de conformación en una enzima polimerasa, el cual se produce cuando un nucleótido se incorpora a la cadena de polinucleotídica naciente. Según la presente invención, un procedimiento para la secuenciación de un polinucleótido comprende las etapas de: (i) hacer reaccionar un polinucleótido molde con una enzima polimerasa inmovilizada en un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, en condiciones suficientes para la reacción de la polimerasa; y (ii) detectar la incorporación de un nucleótido complementario al polinucleótido objetivo, midiendo la 2 radiación. ES 2 183 394 T3 La radiación puede aplicarse a una muestra utilizando un número de técnicas, incluyendo las técnicas de detección sensible en superficiales, donde un cambio en la respuesta óptica en una superficie óptica sólida se utiliza para indicar una interacción de unión en la superficie. En una realización preferida de la invención; se usa la técnica de espectroscopía de ondas evanescentes, en particular la espectroscopía de resonancia del plasmón superficial (SPR). En una realización de la invención, los nucleótidos utilizados en el procedimiento incluyen un grupo bloqueante en la posición 3, y opcionalmente en la posición 5, el cual evita la incorporación de los nucleótidos en la cadena polinucleotídica. Sin embargo, los grupos bloqueantes pueden eliminarse selectivamente para permitir que suceda la incorporación. Utilizando los nucleótidos bloqueantes, es posible llevar a cabo el procedimiento usando todos los nucleótidos presentes en la reacción en un momento dado. La eliminación selectiva de los grupos bloqueantes se lleva a cabo de forma que asegure la detección de cada nucleótido incorporado. Por lo tanto el procedimiento puede proceder en tiempo real, para lograr una alta velocidad de análisis de la secuencia. Descripción de los dibujos La invención se describirá a modo de ejemplo solamente con referencia a los siguientes dibujos, en los que: La Figura 1 es una ilustración esquemática de un análisis de secuencia polinucleotídica utilizando la espectroscopía SPR; y La Figura 2 ilustra las diferentes señales de respuesta detectadas para la polimerización de cada uno de los diferentes nucleótidos. La Figura 3 ilustra el procedimiento de síntesis de los nucleótidos doblemente bloqueados. Descripción de la invención El presente procedimiento para secuenciar un polinucleótido implica el análisis de la interacción cinética entre una enzima polimerasa, un polinucleótido diana y un nucleótido complementario. La medida de la interacción cinética se lleva a cabo controlando los cambios de absorción de la radiación electromagnética u otra que ocurren si la reacción continúa. El término polinucleótido como aquí se usa se ha a interpretar ampliamente, e incluye DNA y RNA, incluyendo DNA y RNA modificados, así como otras moléculas similares de ácidos nucleicos que hibridan, por ejemplo ácido péptido nucleico (PNA). Típicamente, el procedimiento se lleva a cabo aplicando radiación electromagnética, utilizando las técnicas de resonancia del plasmón superficial o resonancia magnética nuclear. Sin embargo, pueden considerarse otras técnicas que miden cambios en la radiación, por ejemplo espectroscopía de fluorescencia reflectante interna total (TIRF), reflexión total atenuada (ATR), reflexión total frustrada (FTR), reflectometría angular de Brewster, reflexión interna total dispersa (STIR) o elipsometría de ondas evanescentess. También se prevén otras técnicas distintas de aquellas que requieren radiación eletromagnética, en particular técnicas fotoquímicas tal como la quimioluminiscencia, y técnicas gravimétricas que incluyen sistemas de resonancia tales como las técnicas de ondas acústicas superficiales (SAW) y técnicas de microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). La espectroscopía de resonancia del plasmón de superficie (SPR) es un procedimiento preferido, y mide las propiedades de una solución detectando las diferencias del índice de refracción entre la fase masal de la solución y la región de ondas evanescentes. La luz monocromática incidente se refleja en un ángulo específico fuera de una superficie óptica sólida (chip sensor) en el lado opuesto a la muestra en estudio. La luz se extiende hacia dentro de la muestra en una distancia muy corta y está afectada por una interacción en la superficie. Los chips sensores adecuados se conocen en la técnica. Típicamente, comprenden un material ópticamente transparente, por ejemplo vidrio, y una película delgada reflectante, por ejemplo plata u oro. Para una revisión de la espectroscopía SPR véase la Publicación de patente europea N . 0648328 3 ES 2 183 394 T3 (la descripción de la cual se incorpora en su totalidad aquí como referencia). La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) es otro procedimiento preferido, y mide las propiedades magnéticas de los compuestos. Los núcleos de los compuestos se orientan energéticamente por una combinación del campo magnético aplicado y una radiación de radiofrecuencia. Cuando la energía ejercida sobre un núcleo iguala a la diferencia de energía entre los estados de rotación (la diferencia entre... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la secuenciación de un polinucleótido, que comprende las etapas de : (i) hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima polimerasa que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, en condiciones suficientes para la reacción de la polimerasa; y (ii) detectar un efecto consecuente a la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido diana, llevándose a cabo la detección mediante medida de la radiación. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo con cada uno de los diferentes nucleótidos por turnos, hasta que se detecta la incorporación, y seguidamente se repite. 3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (i) se se lleva a cabo con todos los nucleótidos presentes. 4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los nucleótidos comprenden un grupo bloqueante en 3 que se elimina después de la reacción de la polimerasa. 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el grupo bloqueante puede eliminarse selectivamente mediante pulsos de luz monocromática. 6. Un procedimiento según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que los nucleótidos comprenden un grupo bloqueante adicional en el grupo fosfato terminal de la cadena de trifosfato, y el grupo bloqueante adicional se elimina antes de la eliminación del grupo bloqueante en 3. 7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el grupo bloqueante adicional puede eliminarse selectivamente mediante pulsos de luz monocromática en condiciones diferentes de las requeridas para eliminar el grupo bloqueante en 3. 8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que el grupo bloqueante adicional se elimina mediante pulsos de luz monocromática de una duración diferente de la requerida para eliminar el grupo bloqueante en 3. 9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (i) comprende además la introducción de un inhibidor competitivo de la enzima polimerasa. 10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polinucleótido dianadelaetapa(i)seunealaenzimapolimerasamedianteuncomplejodedímero ß2. 11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la polimerasa es la DNA polimerasa III de E. coli o la polimerasa T7. 12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la polimerasa es la Taq polimerasa. 13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la polimerasa es la transcriptasa reversa. 14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (ii) comprende la detección de un cambio en la señal de resonancia durante un tiempo. 15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la radiación es electromagnética. 16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que la radiación electromagnética está enel espectro infrarrojo. 17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (ii) comprende el uso de resonancia del plasmón superficial. 9 ES 2 183 394 T3 18. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que la radiación electromagnética está enel espectro de radiofrecuencia. 19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que la incorporación de un nucleótido se detecta usando resonancia magnética nuclear. 20. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polinucleótido es DNA. NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. ES 2 183 394 T3 11 ES 2 183 394 T3 12 ES 2 183 394 T3 13 ES 2 183 394 T3 14 ES 2 183 394 T3