Un método para aislar un ácido nucleico diana de interés a partir de una muestra,

que comprende:

mezclar una muestra que contiene un ácido nucleico diana con una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana en una fase en solución que contiene imidazol como agente químico desnaturalizante y una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura, para proporcionar una mezcla de reacción,

incubar la mezcla de reacción a una primera temperatura en un intervalo de aproximadamente 60ºC a 95ºC durante 1 a 15 minutos, incubar la mezcla de reacción a una segunda temperatura en un intervalo de 25ºC a 42ºC durante 20 minutos o menos, formando de este modo un complejo de hibridación constituido por la sonda de captura hibridada específicamente con el ácido nucleico diana y por la sonda inmovilizada unida específicamente a la sonda de captura, en donde el complejo de hibridación está fijado a un soporte a través de la sonda inmovilizada, y separar el complejo de hibridación fijado al soporte de los otros componentes de la muestra.

Métodos y productos para la captura de ácido nucleico diana Campo de la invención Las composiciones y los métodos descritos se refieren a la biología molecular, más particularmente al aislamiento de ácidos nucleicos a partir de mezclas complejas, tales como muestras, mediante el uso de un oligómero de ácido nucleico específico del ácido nucleico diana y un agente químico desnaturalizante en la mezcla.

Antecedentes de la invención

Muchos procedimientos de biología molecular, tales como la amplificación in vitro y la hibridación in vitro de ácidos nucleicos, requieren una preparación o purificación de los ácidos nucleicos, para volverlos eficaces en el procedimiento posterior. Se han desarrollado métodos de purificación de ácidos nucleicos que no son específicos y se han aislado todos los ácidos nucleicos presentes en una muestra, o se han aislado diferentes tipos de ácidos nucleicos basándose en características físicas, o se han aislado ácidos nucleicos específicos a partir de una muestra. Muchos de los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos implican unos procedimientos complicados o el uso de productos químicos agresivos y requieren mucho tiempo hasta completarse.

El documento de patente de EE.UU. 2002/197614 describe un método para aislar un ácido nucleico diana que comprende poner en contacto una muestra que contiene el ácido nucleico diana con un oligonucleótido adaptador para formar un complejo de hibridación y, a continuación, someter el complejo a electroforesis en gel en un gel de captura universal, que comprende una matriz dentro de la cual se inmoviliza una sonda de captura universal. Se menciona que se puede utilizar urea o una temperatura elevada durante la electroforesis, para incrementar la restricción.

El documento de patente WO 92/15708 describe un método para mejorar la sensibilidad de los ensayos de hibridación que reduce la unión no específica y la hibridación no específica, que incluye lavar utilizando sales de tetraalquilamonio a temperaturas elevadas y la liberación del complejo sonda-diana desde un soporte sólido y la recaptura.

El documento WO 98/50583 describe un método para aislar un ácido nucleico diana que comprende incubar una mezcla del ácido nucleico diana, una sonda de captura y una sonda inmovilizada, con dos tipos de condiciones de hibridación diferentes para controlar el orden de la hibridación, en donde la primera condición de hibridación permite que se hibriden la sonda de captura y la diana, y la segunda condición permite que se hibriden la sonda de captura y la sonda inmovilizada. La primera condición puede incluir la incubación a una temperatura de aproximadamente 60ºC y la segunda condición puede incluir la incubación a una temperatura de aproximadamente 40ºC.

Sigue habiendo una necesidad de un método simple, eficaz y rápido para separar un ácido nucleico de interés a partir de otros componentes de una muestra.

Resumen de la invención

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Se describe un método para aislar un ácido nucleico diana de interés a partir de una muestra, que incluye las etapas de mezclar una muestra que contiene un ácido nucleico diana con una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana, en una fase en solución que contiene un agente químico desnaturalizante y una sonda inmovilizada, que se une específicamente a la sonda de captura, para proporcionar una mezcla de reacción, incubar la mezcla de reacción a una primera temperatura en un intervalo de aproximadamente 60ºC a 95ºC durante aproximadamente 15 minutos o menos, incubar la mezcla de reacción a una segunda temperatura en un intervalo de aproximadamente 25ºC a 42ºC durante aproximadamente 20 minutos o menos, formándose de este modo un complejo de hibridación formado por la sonda de captura hibridada específicamente con el ácido nucleico diana y la sonda inmovilizada, unida específicamente a la sonda de captura, en donde el complejo de hibridación está fijado a un soporte a través de la sonda inmovilizada, y separar el complejo de hibridación fijado al soporte, de otros componentes de la muestra. En una realización preferida, el agente químico desnaturalizante es imidazol, a una concentración de 0, 5 M a 4, 2 M, y la primera incubación se realiza a aproximadamente 60ºC, durante aproximadamente 1 a 15 minutos. Otras realizaciones preferidas, emplean imidazol a una concentración de 3, 0 M a 3, 5 M, y se incuba a una temperatura de 60ºC durante aproximadamente 1 a 15 minutos. En otras realizaciones preferidas, el imidazol tiene una concentración de 2, 0 M a 2, 7 M y la primera incubación se realiza a aproximadamente 90ºC a 95ºC, durante aproximadamente 3 a 10 minutos. En algunas realizaciones preferidas, el agente químico desnaturalizante es imidazol a una concentración de 2, 7 M, la temperatura de la primera incubación es de aproximadamente 75ºC a 95ºC, durante aproximadamente 3 a 15 minutos, y el método incluye además la incubación de la mezcla de reacción a aproximadamente 60ºC, durante aproximadamente 20 minutos entre la primera y la segunda etapa de incubación. En una realización preferida que utiliza imidazol a una concentración de 2, 7 M, la temperatura de la primera incubación es de aproximadamente 95ºC, durante aproximadamente 3 a 15 minutos, y el método incluye incubar la mezcla de reacción a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 20 minutos, entre la primera y la segunda etapa de incubación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico total o parcialmente bicatenario, o un ácido nucleico que incluye otra estructura secundaria o terciaria. En una realización, la sonda de captura está formada por una secuencia específica de la diana que se une al ácido nucleico diana y una región de la cola que se une a la sonda inmovilizada a través de un ligando específico. En una realización preferida, la región de cola de la sonda de captura se une a la sonda inmovilizada mediante hibridación específica con una secuencia complementaria de la sonda inmovilizada. Algunas realizaciones preferidas también incluyen detectar el ácido nucleico diana o un producto de la amplificación in vitro, preparado a partir del ácido nucleico diana después de separar el complejo de hibridación fijado al soporte, de otros componentes de la muestra.

Se describe un método para aislar un ácido nucleico diana de interés, a partir de una muestra que incluye las etapas de mezclar una muestra que contiene un ácido nucleico diana, con una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana, en una fase en solución que contiene un agente químico desnaturalizante y una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura, para proporcionar una mezcla de reacción, incubar la mezcla de reacción a aproximadamente 25ºC durante aproximadamente 1 a 60 minutos, formando de este modo un complejo de hibridación formado por la sonda de captura hibridada específicamente con el ácido nucleico diana y la sonda inmovilizada unida específicamente a la sonda de captura, en donde el complejo de hibridación está fijado a un soporte a través de la sonda inmovilizada, y separar el complejo de hibridación fijado al soporte, de otros componentes de la muestra. En una realización preferida, el agente químico desnaturalizante es imidazol, a una concentración entre 0, 05 M y 0, 5 M y la incubación es durante aproximadamente 2 a 30 minutos. En una realización preferida, el imidazol tiene una concentración de aproximadamente 0, 5 M y la incubación es durante aproximadamente 15 minutos.

Se describe una composición para la captura específica de un ácido nucleico diana, que incluye al menos un ácido nucleico diana, al menos una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana, una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura, y una mezcla de hibridación en solución que contiene imidazol a una concentración de 0, 05 M a 4, 2 M. En algunas realizaciones preferidas, la mezcla contiene imidazol de 0, 05 a 0, 5 M, mientras que en otras realizaciones preferidas, la mezcla contiene imidazol de 1, 7 M a 3, 5 M. En algunas realizaciones preferidas, la mezcla de hibridación contiene imidazol de 2, 0 M a 2, 7 M. En una realización preferida, la composición incluye una primera sonda de captura que se hibrida específicamente con una primera secuencia diana y una segunda sonda de captura que se hibrida específicamente con una segunda secuencia diana que es diferente... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar un ácido nucleico diana de interés a partir de una muestra, que comprende:

mezclar una muestra que contiene un ácido nucleico diana con una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana en una fase en solución que contiene imidazol como agente químico desnaturalizante y una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura, para proporcionar una mezcla de reacción,

incubar la mezcla de reacción a una primera temperatura en un intervalo de aproximadamente 60ºC a 95ºC durante 1 a 15 minutos, incubar la mezcla de reacción a una segunda temperatura en un intervalo de 25ºC a 42ºC durante 20 minutos o menos, formando de este modo un complejo de hibridación constituido por la sonda de captura hibridada específicamente con el ácido nucleico diana y por la sonda inmovilizada unida específicamente a la sonda de captura, en donde el complejo de hibridación está fijado a un soporte a través de la sonda inmovilizada, y separar el complejo de hibridación fijado al soporte de los otros componentes de la muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente químico desnaturalizante es imidazol a una concentración de 0, 5 M a 4, 2 M, y la incubación a la primera temperatura se realiza a 60ºC durante 1 a 15 minutos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente químico desnaturalizante es imidazol a una concentración de 3, 0 M a 3, 5 M, y la incubación a la primera temperatura se realiza a 60ºC durante 1 a 15 minutos.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente químico desnaturalizante es imidazol a una concentración de 2, 0 M a 2, 7 M, y la incubación a la primera temperatura se realiza desde 90ºC a 95ºC durante 3 a 10 minutos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente químico desnaturalizante es imidazol 2, 7 M, la incubación a la primera temperatura se realiza de 75ºC a 95ºC durante 3 a 15 minutos, y el método incluye adicionalmente la incubación de la mezcla de reacción a 60ºC durante 20 minutos entre la primera y la segunda etapas de incubación.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la incubación a la primera temperatura se realiza a 95ºC durante 3 a 15 minutos.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico diana es ácido nucleico completa

o parcialmente bicatenario, o un ácido nucleico que incluye otra estructura secundaria o terciaria.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sonda de captura se compone de una secuencia específica de la diana que se une al ácido nucleico diana y de una región de cola que se une a la sonda inmovilizada a través de un ligando específico.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la región de cola se une a la sonda inmovilizada mediante hibridación específica con una secuencia complementaria de la sonda inmovilizada.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de detección del ácido nucleico diana o de un producto de la amplificación in vitro, obtenido a partir del ácido nucleico diana después de separar el complejo de hibridación fijado al soporte, de otros componentes de la muestra.

11. Un método para aislar un ácido nucleico diana de interés a partir de una muestra, que comprende:

mezclar una muestra que contiene un ácido nucleico diana con una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana en una fase en solución que contiene imidazol a una concentración entre 0, 05 M y 0, 5 M como agente químico desnaturalizante, y una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura, para proporcionar una mezcla de reacción,

incubar la mezcla de reacción a 25ºC durante 1 minuto a 60 minutos, formando de este modo un complejo de hibridación constituido por la sonda de captura hibridada específicamente con el ácido nucleico diana y por la sonda inmovilizada unida específicamente a la sonda de captura, en donde el complejo de hibridación está fijado a un soporte a través de la sonda inmovilizada, y separar el complejo de hibridación fijado al soporte, de otros componentes de la muestra.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la etapa de incubación se realiza durante 2 a 30 minutos.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente químico desnaturalizante es imidazol a una concentración de 0, 5 M y la etapa de incubación se realiza durante 15 minutos.

14. Una composición para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11, que consiste en

(1) imidazol en una cantidad que, si se mezcla con una muestra, produce una mezcla de hibridación en fase en solución que contiene imidazol a una concentración de 0, 05 M a 4, 2 M,

(2) al menos una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana, y

(3) una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la mezcla de hibridación en fase de solución contiene imidazol a una concentración comprendida entre 0, 05 y 0, 5 M.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la mezcla de hibridación en fase en solución contiene imidazol a una concentración comprendida entre 1, 7 M y 3, 5 M.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la mezcla de hibridación en fase en solución contiene imidazol a una concentración comprendida entre 2, 0 M y 2, 7 M.

18. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la composición incluye una primera sonda de captura que se hibrida específicamente con una primera secuencia diana y una segunda sonda de captura que se hibrida específicamente con una segunda secuencia diana que es diferente de la primera secuencia diana.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la mezcla de hibridación en fase en solución contiene imidazol a una concentración seleccionada entre el grupo consistente en: de 0, 5 M a 4, 2 M; de 3, 0 M a 3, 5 M; de 2, 0 M a 2, 7 M; y2, 7.

20. Una mezcla de reacción para aislar un ácido nucleico diana que comprende los siguientes componentes:

(i) una muestra que contiene un ácido nucleico diana;

(ii) una fase en solución que contiene imidazol;

(iii) una sonda de captura que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el ácido nucleico diana en una fase en solución que contiene imidazol a una concentración comprendida entre 0, 05 M y 4, 2 M; y (iv) una sonda inmovilizada que se une específicamente a la sonda de captura en la fase en solución.

21. Un equipo de reactivos que contiene componentes útiles para aislar un ácido nucleico diana que comprende:

(i) al menos una sonda de captura específica del ácido nucleico diana;

(ii) un soporte que tiene un ligando inmovilizado para la sonda de captura; e

(iii) imidazol en una fase soluble.