OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA DETECCION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B.

Un oligonucleótido que consiste en una secuencia seleccionada a partir del grupo consistente en SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y sus secuencias complementarias

Oligonucleótidos para la detección del virus de la hepatitis B.

La presente invención se refiere a cebadores de oligonucleótidos y a sondas para una detección rápida y sensible del virus de la hepatitis B, mediante amplificación, y a métodos que emplean los mismos.

El virus de la hepatitis B (VHB) es un miembro de la familia Hepadnaviridae. Estos son virus de ADN bicatenario que se replican inusualmente, mediante transcripción inversa. Se ha descrito una variedad de variantes de este virus. El VHB es el principal agente causal de la hepatitis crónica y está implicado en la cirrosis hepática y en el carcinoma hepatocelular. El virus de la hepatitis B es endémico en la población humana e hiperendémico en muchas partes del mundo. Se estima que más de un tercio de la población mundial ha estado infectada con el virus de la hepatitis B. Aproximadamente el 5% de la población, son portadores crónicos del VHB y cerca del 25% de todos los portadores, desarrollan enfermedades hepáticas graves tales como hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular primario. La infección con VHB causa más de un millón de muertes cada año.

Las respuestas inmunes mediadas con anticuerpos y por células, frente a varios tipos de antígenos, se inducen durante la infección. La respuesta inmune frente a una infección con el virus de la hepatitis B, se dirige por lo menos hacia tres antígenos: el antígeno de la superficie de la hepatitis B, el antígeno del núcleo (HBcAg) y el antígeno e (HBeAg). El antígeno de la superficie aparece en el suero de la mayoría de los pacientes durante el estado tardío del periodo de incubación, es decir, 2-8 semanas después de la infección, y persiste durante la enfermedad aguda y disminuye bruscamente cuando se vuelve detectable el anticuerpo contra el antígeno de la superficie. La IgM para el antígeno del núcleo se encuentra en el suero, de 2-10 semanas después de que aparezca el antígeno de superficie. Se correlaciona con la cantidad y la duración de la replicación vírica. Como el antígeno e de la hepatitis B, es secretado por hepatocitos infectados, pero en casi todos los individuos se observa, eventualmente, una seroconversión de HBeAg a anti-HBe, asociada con el aclaramiento de los hepatocitos infectados.

Los inmunoensayos se han desarrollado para detectar y medir los antígenos y los anticuerpos del VHB.

Sin embargo tales inmunoensayos pueden generar falsos resultados negativos. Además, cuando se lleva a cabo un método inmunológico dentro de la fase de seroconversión del individuo, la infección con VHB puede quedar sin detectar ya que no se encontraría ningún antígeno o anticuerpo circulante. Por tanto, los métodos de diagnóstico que dependen de la detección de ácido nucleico de VHB, proporcionan un método más preciso que permite una detección más temprana del virus.

El documento de patente de EE.UU. nº 2003/0157478 describe un método y un equipo de reactivos para diagnosticar VHB mediante PCR y la hibridación con una sonda para la detección.

Algunos equipos de reactivos para diagnóstico se han comercializado en este campo, por ejemplo, Amplicor HBV Monitor y Cobas Amplicor HBV Monitor (Roche Molecular Systems), Versant HBV DNA (bADN, Bayer Diagnostics) y el ensayo de ADN de Digene Hybrid-Capture 2 HBV (Digene Corporation). Sin embargo, estos ensayos tienen generalmente un campo de cuantificación limitado, con no más de 4 log: 10³ hasta 4 10⁶ copias/ml para Amplicor HBV Roche (2 10² hasta 2 10⁵ copias/ml para Cobas HBV Roche), 7 10⁵ hasta 5 10⁹ copias/ml para Versant HBV Bayer y 7 10⁵ hasta 5,6 10⁹ copias/ml para Digene HBV DNA (4,7 10³ hasta 5,7 10⁷ copias/ml para Ultrasensitive Digene HBV DNA). Por tanto, el inconveniente principal de todos estos ensayos reside en el hecho de que ninguno de ellos hace posible una cuantificación clara y sencilla del VHB desde concentraciones muy bajas hasta muy altas. Por lo tanto, todavía es necesario frecuentemente combinar al menos dos ensayos para poder obtener un resultado fiable, particularmente en caso de tener un nivel de concentración vírica alto o bajo.

Por ello, existe una necesidad de una cuantificación fiable del VHB en un grado extenso, cualquiera que sea la concentración del virus en una muestra y sin la necesidad de realizar ningún ensayo adicional.

Además, todavía existe la necesidad de un ensayo cuantitativo sensible que detecte específicamente todos los genotipos de VHB conocidos en la técnica.

En este contexto, los inventores han diseñado cebadores y sondas que proporcionan unos medios particularmente rápidos y sensibles para detectar el ácido nucleico de VHB, procedente de genotipos A hasta G con un amplio grado de cuantificación.

Definiciones

De acuerdo con la presente invención, se puede emplear cualquier técnica convencional de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante dentro del estado de la técnica. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook y col., 1989; "DNA Cloning: A Practical Approach". Volúmenes I y II (compilador D. N. Glover, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (compilador M. J. Gait, 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [compiladores B. D. Hames & S. J. Higgins (1985)]; "Transcription and Translation" [compiladores B. D. Hames & S. J. Higgins (1984)]; "Animal Cell Culture" [compilador R. I. Freshney, (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, 1984; F. M. Ausubel y col. (compiladores), 1994.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier ácido nucleico: puede ser sintético o no, recombinante o estar presente en la naturaleza, ser linear o circular. Puede estar en forma monocatenaria o bicatenaria. Estas moléculas de ácido nucleico incluyen ADN genómico, ADNc o ARN. A no ser que se especifique de otro modo, las secuencias se describen según la convención normal de dar las secuencias sólo en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN no transcrita (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm).

Tal y como se emplea en esta memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede emplear como cebador en un procedimiento de amplificación o como sonda en un método de detección, En el contexto de la invención, estos oligonucleótidos consisten en al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 20 nucleótidos, preferentemente no más de 100 nucleótidos, más preferentemente no más de 40 nucleótidos que sean hibridables con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc o una molécula de ARNm que codifica un gen, un ARNm, un ADNc u otro ácido nucleico de interés.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, un ADN genómico o un ARN, cuando una forma con cadena sencilla de la molécula de ácido nucleico se puede reasociar con la otra molécula de ácido nucleico, bajo unas condiciones adecuadas de temperatura y de fuerza iónica de la solución (véase, Sambrook y col., 1989). Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan las "condiciones rigurosas" de la hibridación. Las condiciones rigurosas para hibridar ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud o de homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que se corresponde con una Tm superior) de las hibridaciones de ácido nucleico, disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos con más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook y col, 1989, 9.50-9.51). Para hibridar ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desemparejamientos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y col., 1989, 11.7-11.8). Una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 10 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 15 nucleótidos y más preferentemente la longitud es al menos aproximadamente 20 nucleótidos.

La PCR se realiza bajo condiciones muy rigurosas, empleando una temperatura de reasociación de al menos 50ºC, en un tampón con fuerza iónica elevada....

1. Un oligonucleótido que consiste en una secuencia seleccionada a partir del grupo consistente en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y sus secuencias complementarias.

2. El oligonucleótido según la reivindicación 1, que consiste en SEQ ID NO: 2 o su secuencia complementaria.

3. El oligonucleótido según la reivindicación 1, que consiste en SEQ ID NO: 3 o su secuencia complementaria.

4. El oligonucleótido según la reivindicación 1, que consiste en SEQ ID NO: 4 o su secuencia complementaria.

5. El oligonucleótido según la reivindicación 1, que consiste en SEQ ID NO: 6 o su secuencia complementaria.

6. El oligonucleótido según la reivindicación 1, que consiste en SEQ ID NO: 7 o su secuencia complementaria.

7. Uso de un oligonucleótido tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, como sonda o cebador para la hibridación y la amplificación de un ácido nucleico procedente de un virus de la hepatitis B (VHB).

8. Uso de un oligonucleótido que consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, ligado opcionalmente en el extremo 5' y/o 3' terminal con secuencias adicionales incapaces de hibridarse con los ácidos nucleicos de VHB bajo condiciones de hibridación convencionales, como sonda para la hibridación con un ácido nucleico procedente de VHB.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias.

10. El uso según la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, y es portador de un resto fluoróforo en un extremo, y un resto inhibidor de la fluorescencia en el otro extremo.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que dicho oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15, y es portador de un resto fluoróforo en un extremo y un resto inhibidor de la fluorescencia en el otro extremo.

12. Un grupo de oligonucleótidos que consisten en un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y al menos un oligonucleótido seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7.

13. Un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 12, que consiste en:

(i) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:3;

(ii) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:4;

(iii) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:5;

(iv) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:6;

(v) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:7;

(vi) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:4 y un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:5; y

(vii) un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:2, un oligonucleótido que consiste en SEQ ID NO:6; y un oligonucleótido que incluye SEQ ID NO:7.

14. Un grupo de oligonucleótidos que comprende:

a) un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 12 ó 13; y

b) un oligonucleótido que incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias.

15. Un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 14, que comprende:

a) un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 12 ó 13; y

b) un oligonucleótido que consiste en un secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15 y que es portador de un resto fluoróforo en un extremo y un resto inhibidor de la fluorescencia en el otro extremo.

16. Un método para detectar específicamente un VHB mediante la amplificación en una muestra biológica, cuyo método comprende las etapas consistentes en:

a) poner en contacto un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 12 ó 13, con una muestra biológica o una preparación de ácido nucleico obtenida a partir de una muestra biológica, bajo condiciones adecuadas para que los oligonucleótidos se hibriden con un ácido nucleico de VHB presente en la muestra;

b) amplificar dicho ácido nucleico de VHB empleando dichos oligonucleótidos como cebadores;

c) detectar el producto de la amplificación, indicativo de la presencia de un VHB en la muestra biológica.

17. El método según la reivindicación 16, en el que el ácido nucleico de VHB se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

18. El método según la reivindicación 16 ó 17, en el que la detección de dicho producto de la amplificación se realiza utilizando un oligonucleótido que incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, y que se marca de forma detectable como una sonda.

19. El método según la reivindicación 18, en donde dicho oligonucleótido incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, y es portador de un resto fluoróforo en un extremo terminal y un resto inhibidor de la fluorescencia en el otro extremo terminal.

20. El método según la reivindicación 18 ó 19, en donde dicho oligonucleótido que incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, es SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.

21. Un equipo de reactivos para amplificar VHB en una muestra biológica, cuyo equipo comprende:

- al menos un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 12 ó 13, útiles como cebadores;

- medios para amplificar un ácido nucleico de VHB.

22. El equipo de reactivos según la reivindicación 21, que comprende adicionalmente unos medios para la detección del producto amplificado.

23. El equipo de reactivos según la reivindicación 21 ó 22, en el que los medios para amplificar el ácido nucleico de VHB son medios para amplificar con la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

24. El equipo de reactivos según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, que comprende un oligonucleótido que incluye una secuencia seleccionada a partir del grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, marcada de forma detectable y útil como sonda.

25. El equipo de reactivos según la reivindicación 24, en el que dicho oligonucleótido que incluye una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y sus secuencias complementarias, es SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.