Un método para la amplificación selectiva de al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de una muestra de ácido nucleico,

y dicho método comprende las etapas de: (a) tratar una muestra de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido marcado que comprende primeras y segundas regiones, y dicha primera región comprende una secuencia de hibridación al objetivo que hibrida a un extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y dicha segunda región comprende una secuencia marcadora situada en 5' respecto de dicha secuencia de hibridación al objetivo, en la que dicha segunda región no hibrida de manera estable a un ácido nucleico objetivo que contiene dicha secuencia de ácido nucleico objetivo; (b) eliminar y/o inactivar en dicha muestra de ácido nucleico el oligonucleótido marcado sin hibridar que tiene una forma activa en la que una secuencia de hibridación al objetivo de dicho oligonucleótido marcado sin hibridar está disponible para la hibridación a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo; (c) tras la etapa (b), iniciar una reacción de prolongación desde el extremo 3' de dicho oligonucleótido marcado hibridado a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con una ADN polimerasa para producir un producto de prolongación de cebador que incluye la secuencia marcadora y una región complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo; (d) separar dicho producto de prolongación de cebador de dicho ácido nucleico objetivo; y (e) producir productos de amplificación en una reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de primeros y segundos oligonucleótidos, en los que dicho primer oligonucleótido comprende una secuencia de hibridación que hibrida a un extremo 3' del complemento de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y dicho segundo oligonucleótido comprende una secuencia de hibridación que hibrida al complemento de dicha secuencia marcadora, en el que dicho segundo oligonucleótido hibrida de manera estable a dicho ácido nucleico objetivo, y en el que cada uno de dichos productos de amplificación comprende una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica o complementaria a la secuencia de bases de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y que comprende además una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica o complementaria a toda o a una parte de dicha secuencia marcadora

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a métodos, composiciones, mezclas de la reacción y equipos para la amplificación selectiva de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico específica o "secuencia objetivo" que puede estar presente sola o como componente de una mezcla homogénea o heterogénea de ácidos nucleicos. La mezcla de ácidos nucleicos puede ser la que se halla en una muestra tomada para un ensayo de diagnóstico, cribado de productos sanguíneos, análisis de esterilidad, detección microbiológica en alimentos, agua, bebidas, muestras industriales o ambientales, estudios de investigación, preparación de reactivos o de materiales para otros procedimientos tales como clonación, o para otros fines. La amplificación selectiva de las secuencias de ácidos nucleicos específicas, tal como se describe en la presente memoria, tiene un valor particular en cualquiera de una diversidad de ensayos de detección para incrementar la exactitud y la fiabilidad de tales ensayos, mientras al mismo tiempo se reducen los requisitos de preparación, purificación y/o esterilización para los reactivos usados en los ensayos, y para el medio en el que se llevan a cabo los ensayos.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La detección y/o la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos específicas es una técnica importante para detectar y clasificar microorganismos, para diagnosticar enfermedades infecciosas, para medir la respuesta a diversos tipos de tratamientos, y similares. Tales procedimientos son útiles también en la detección y la cuantificación de microorganismos en productos alimenticios, agua, bebidas, muestras industriales y ambientales, reservas de semillas, y otros tipos de materiales en los que puede ser necesario monitorizar la presencia de microorganismos específicos.

Se conocen muy bien numerosos métodos basados en la amplificación para la detección y la cuantificación de ácidos nucleicos objetivo, y están establecidos en la técnica. La reacción en cadena de la polimerasa, denominada habitualmente PCR, usa múltiples ciclos de desnaturalización, renaturalización de los pares de cebadores a las cadenas opuestas, y prolongación de los cebadores para incrementar exponencialmente el número de copias de la secuencia objetivo (p.ej., Mullis et al., "Process for Amplifying, Detecting and/or Cloning Nucleic Acid Sequences", pat. de EE.UU. nº 4.683.195; Mullis, "Process for Amplifying Nucleic Acid Sequences", pat. de EE.UU. nº 4.683.202; Mullis et al., "Process for Amplifying, Detecting and/or Cloning Nucleic Acid Sequences", pat. de EE.UU. nº 4.800.159; Gelfand et al., "Reaction Mixtures for the Detection of Target Nucleic Acids", pat. de EE.UU. nº 5.804.375; Mullis et al. (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350; y Murakawa et al. (1988) DNA 7, 287-295).

En una variación denominada RT-PCR, se usa la transcriptasa inversa (RT) para producir un ADN complementario (cADN) a partir de ARN, y el cADN se amplifica después mediante PCR para producir múltiples copias de ADN (Gelfand et al., "Reverse Transcription with Thermostable DNA Polymerases - High Temperature Reverse Transcription", pat. de EE.UU. nºs 5.322.770 y 5.310.652).

Otro método de amplificación muy conocido es la amplificación mediante desplazamiento de cadenas, denominado habitualmente SDA, que usa ciclos de renaturalización de pares de secuencias de cebadores a las cadenas opuestas de una secuencia objetivo, la prolongación de los cebadores en presencia de un dNTP para producir un producto de prolongación de cebadores hemifosforotioado bicatenario, la formación de una mella mediada por endonucleasa en un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción hemi-modificado, y la prolongación de los cebadores mediada por polimerasa desde el extremo 3' de la mella para desplazar la cadena existente y producir una cadena para la siguiente ronda de renaturalización del cebador, formación de mella y desplazamiento de la cadena, lo que da como resultado la amplificación geométrica del producto (p.ej., Walker, G. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396; Walker et al., "Nucleic Acid Target Generation", pat. de EE.UU. nº 5.270.184; Walker, "Strand Displacement Amplification", pat. de EE.UU. nº 5.455.166; y Walker et al. (1992) Nucleic Acids Research 20, 1691-1696). La SDA termófila (tSDA) usa endonucleasas y polimerasas termófilas a temperaturas superiores esencialmente en el mismo método (pat. europea nº 0 684 315).

Otros métodos de amplificación incluyen la amplificación por círculo rodante (RCA) (p.ej., Lizardi, "Rolling Circle Replication Reporter Systems", pat. de EE.UU. nº 5.854.033); la amplificación dependiente de helicasa (HDA) (p.ej., Kong et al., "Helicase Dependent Amplification Nucleic Acids", pub. de sol. de pat. de EE.UU. nº US 2004-0058378 A1); y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (p.ej., Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid", pat. de EE.UU. nº 6.410.278).

Los métodos de amplificación basados en la transcripción usados habitualmente en la técnica incluyen la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, también denominada NASBA (p.ej., Malek et al., pat. de EE.UU. nº 5.130.238); los métodos que se basan en el uso de una ARN replicasa para amplificar la molécula de sonda propiamente dicha, denominada habitualmente Qβ replicasa (p.ej., Lizardi, P. et al. (1988) BioTechnol. 6, 1197-1202); los métodos de amplificación basados en la transcripción (p.ej., Kwoh, D. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177) y la replicación de secuencias auto-sostenida (p.ej., Guatelli, J. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878; Landgren (1993) Trends in Genetics 9, 199-202; y HELEN H. LEE et al., NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES (1997)).

Otro método de amplificación basado en la transcripción es la amplificación mediada por la transcripción, denominado habitualmente TMA, que sintetiza múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico objetivo de manera autocatalítica en condiciones sustancialmente constantes de temperatura, fuerza iónica y pH, en el que múltiples copias de ARN de la secuencia objetivo generan copias adicionales de manera autocatalítica (p.ej., Kacian et al., "Nucleic Acid Sequence Amplification Methods", pat. de EE.UU. nº 5.480.784; y Kacian et al., pat. de EE.UU. nº 5.399.491). TMA es un sistema de amplificación sólido y sumamente sensible con una eficacia demostrada, que supera muchos de los problemas asociados a los sistemas de amplificación basados en PCR. En particular, los ciclos de temperatura no son necesarios.

Los ensayos de amplificación son especialmente adecuados para la detección de microorganismos en el contexto de los ensayos de laboratorio clínico, la monitorización de bioprocesos, o cualquier otra situación en la que se desea la detección de microorganismos en un tipo de muestra particular, ofreciendo una sensibilidad elevada y un tiempo rápido para la obtención de resultados respecto de las técnicas microbiológicas convencionales. Además, se pueden usar los métodos de amplificación en la detección del gran número de microorganismos que son difíciles o imposibles de cultivar en medios sintéticos. Sin embargo, existen ciertas limitaciones asociadas a los ensayos de amplificación de primera generación que han limitado su aceptación en ciertas situaciones, tales como los laboratorios de microbiología clínica. Un problema intrínseco asociado a la elevada sensibilidad de los sistemas de amplificación de ácidos nucleicos es que el ácido nucleico contaminante introducido en el sistema de amplificación (p.ej., de uno o más reactivos utilizados durante la amplificación, del técnico que lleva a cabo el ensayo, del medio en el que se lleva a cabo la amplificación, etc.) puede proporcionar resultados positivos falsos. Por ejemplo, incluso las cantidades extremadamente pequeñas de contaminación de ácidos nucleicos presentes en los reactivos y/o las enzimas usadas en una reacción de amplificación, o en el medio en el que se lleva a cabo la reacción de amplificación, pueden dar lugar a una señal de amplificación positiva a pesar del hecho de que la secuencia de interés no esté presente en la muestra de ácido nucleico que se esté ensayando. Esto requiere que se invierta un esfuerzo significativo en la preparación de la muestra, la purificación, la esterilización, etc. de los reactivos usados en las reacciones de amplificación para evitar o minimizar los resultados positivos falsos.

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1. Un método para la amplificación selectiva de al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de una muestra de ácido nucleico, y dicho método comprende las etapas de:

(a) tratar una muestra de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido marcado que comprende primeras y segundas regiones, y dicha primera región comprende una secuencia de hibridación al objetivo que hibrida a un extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y dicha segunda región comprende una secuencia marcadora situada en 5' respecto de dicha secuencia de hibridación al objetivo, en la que dicha segunda región no hibrida de manera estable a un ácido nucleico objetivo que contiene dicha secuencia de ácido nucleico objetivo;

(b) eliminar y/o inactivar en dicha muestra de ácido nucleico el oligonucleótido marcado sin hibridar que tiene una forma activa en la que una secuencia de hibridación al objetivo de dicho oligonucleótido marcado sin hibridar está disponible para la hibridación a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo;

(c) tras la etapa (b), iniciar una reacción de prolongación desde el extremo 3' de dicho oligonucleótido marcado hibridado a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con una ADN polimerasa para producir un producto de prolongación de cebador que incluye la secuencia marcadora y una región complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico objetivo;

(d) separar dicho producto de prolongación de cebador de dicho ácido nucleico objetivo; y

(e) producir productos de amplificación en una reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de primeros y segundos oligonucleótidos, en los que dicho primer oligonucleótido comprende una secuencia de hibridación que hibrida a un extremo 3' del complemento de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y dicho segundo oligonucleótido comprende una secuencia de hibridación que hibrida al complemento de dicha secuencia marcadora, en el que dicho segundo oligonucleótido hibrida de manera estable a dicho ácido nucleico objetivo, y en el que cada uno de dichos productos de amplificación comprende una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica o complementaria a la secuencia de bases de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y que comprende además una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica o complementaria a toda o a una parte de dicha secuencia marcadora.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácido nucleico objetivo está inmovilizada en un soporte sólido durante la etapa (b).

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa (b) comprende eliminar el oligonucleótido marcado sin hibridar de dicha muestra de ácido nucleico.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las condiciones de dicha amplificación de ácido nucleico son isotérmicas.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de amplificación basada en la transcripción.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha reacción de amplificación basada en la transcripción es TMA.

7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que dicho primer oligonucleótido comprende un promotor para una ARN polimerasa que está situado en 5' respecto de dicha secuencia de hibridación.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho primer oligonucleótido está modificado para impedir la iniciación de la síntesis de ADN a partir de él.

9. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que dicho segundo oligonucleótido comprende un promotor para una ARN polimerasa que está situado en 5' respecto de dicha secuencia de hibridación, y en el que dicho oligonucleótido marcado comprende además un promotor para una ARN polimerasa que está situado en 5' respecto de dicha segunda región.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha secuencia de ácido nucleico objetivo está contenida en el ácido nucleico de una única especie de microorganismo.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha secuencia de ácido nucleico objetivo está contenida en el ácido nucleico de múltiples especies de microorganismos.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho método es selectivo para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo contenida en cada una de una

diversidad de ácidos nucleicos objetivo, y en el que dicha secuencia de hibridación al objetivo hibrida a un extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo de cada uno de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo presentes en dicha muestra de ácido nucleico en la etapa (a).

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicha secuencia de ácido nucleico objetivo de cada uno de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo es la misma secuencia de ácido nucleico.

14. El método de la reivindicación 12, en el que dicho primer oligonucleótido hibrida a un extremo 3' del complemento de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo de cada uno de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo presentes en dicha muestra de ácido nucleico en la etapa (e).

15. El método de la reivindicación 12, en el que dicho método comprende una diversidad de primeros oligonucleótidos, y cada uno de dicha diversidad de primeros oligonucleótidos hibrida a un extremo 3' del complemento de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo de al menos uno, pero menos de todos, de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo presentes en dicha muestra de ácido nucleico en la etapa (e).

16. El método de la reivindicación 12, en el que dicho oligonucleótido marcado es un oligonucleótido bacteriano universal.

17. El método de la reivindicación 12, en el que dicho oligonucleótido marcado es un oligonucleótido fúngico universal.

18. El uso del método de la reivindicación 12 para analizar la esterilidad.

19. El uso del método de la reivindicación 12 para diagnosticar la sepsis.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que dicha secuencia de hibridación al objetivo hibrida a un extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo de cada uno de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo presentes en dicha muestra de ácido nucleico en la etapa (a), y dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo pertenece a una clase de microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Eubacterias, bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas y hongos.

21. El uso de la reivindicación 20, en el que cada uno de dicha diversidad de ácidos nucleicos objetivo es un ácido nucleico ribosómico.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que dicha muestra de ácido nucleico se expone a una fuente contaminante conocida de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo tras la etapa (b), y en el que la producción de dichos productos de amplificación se limita sustancialmente a la amplificación de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo aportada por dicha muestra de ácido nucleico, y no por dicha fuente contaminante de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo.

23. El método o el uso de la reivindicación 22, en el que uno o más componentes usados en dicho método es una fuente contaminante conocida de dicho ácido nucleico objetivo.

24. El método o el uso de la reivindicación 23, en el que uno o más reactivos usados en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico se produce con un material que se sabe que es una fuente contaminante de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo.

25. El método o el uso de la reivindicación 24, en el que dichos uno o más reactivos se producen mediante el uso de un microorganismo que contiene dicha secuencia de ácido nucleico objetivo.

26. El método o el uso de la reivindicación 22, en el que las condiciones ambientales de dicho método incluyen una fuente contaminante conocida de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 22 a 26 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, en el que al menos una parte de dicha muestra de ácido nucleico se obtiene a partir de una fuente clínica, de agua, industrial, ambiental, de semillas, de bebidas o de alimentos.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 22 a 27 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, en el que el oligonucleótido marcado sin hibridar se inactiva bloqueando que la secuencia de hibridación al objetivo hibride a la secuencia de ácido nucleico objetivo, usando una enzima para digerir un componente o escindir un sitio de una molécula bicatenaria formada entre la secuencia de hibridación al objetivo y la secuencia de ácido nucleico objetivo, o alterando químicamente la secuencia de hibridación al objetivo, o alterando por otros medios la capacidad del oligonucleótido marcado de hibridar a la secuencia de ácido nucleico objetivo en una mezcla de reacción de amplificación.